Neurospora crassa 產木聚糖酶發酵條件及酶學特性

曹 慧 張朋振 張騰月，2 程 鵬 楊佳萌 任世威 井佳騏

(1.河南科技大學動物科技學院，河南洛陽471000；2.廣東海洋大學農學院，廣東湛江524088)

木聚糖是由多個D-木糖殘基通過β-1，4 糖苷鍵連接而成[1]，是谷物及其副產品中非淀粉多糖的重要組分，是細胞壁中半纖維素的主要成分，是自然界中除纖維素外含量最豐富的多糖[2]，廣泛存在于玉米芯、秸稈、麥麩、甘蔗渣等農作物廢棄物中[3]。木聚糖酶能夠水解木聚糖中的糖苷鍵并生成低聚木糖、木糖和阿拉伯糖降解產物[4]，在食品、飼料、造紙等行業有著廣泛的用途。在飼料行業中，木聚糖酶可以通過降低食糜黏度、減少飼料內源損失、改善腸道內的菌群結構來改善畜禽生產性能，提高養分和能量的利用效率[5]；在造紙行業中，用于紙漿漂白，提高紙漿白度，減少化學漂白劑用量[6]；在食品行業中，木聚糖酶能顯著提高全麥面包和冷凍面團面品質[7-8]。不同的應用環境對酶的要求不同，因此開發適用于不同用途的木聚糖酶非常必要，目前的研究熱點主要是新酶的挖掘和酶分子改造[9-11]。

青藏高原被譽為世界屋脊，地球“第三極”，具有海拔高、輻射強、含氧量低、晝夜溫差大等特點，其獨特的自然地理環境賦予了青藏高原地區豐富而獨特的微生物資源[12-14]。本研究團隊前期從青藏高原土壤中分離出一株高產木聚糖酶菌株Neurospora crassaSD10，對菌株產木聚糖酶發酵條件進行優化，并對酶學性質進行研究，以期為今后構建木聚糖酶工程菌及其在生產上的應用打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種來源

從青藏高原(青海省海北州門源縣，37° N、101° E)海拔3 175 m處采集土壤，經實驗室分離、篩選出菌株Neurospora crassaSD10并保存。

1.1.2 培養基

發酵培養基：木聚糖5.0 g/L、NaNO33.0 g/L、K2HPO4·3H2O 1.31 g/L、KCl 0.5 g/L、蛋白胨3.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.01 g/L、pH值5.5～6.0，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 主要試劑

木聚糖為自提玉米芯木聚糖，提取方法參考趙龍妹等[15]；3，5-二硝基水楊酸(DNS)試劑配制參考王明瑞等[16]；真菌基因組DNA 快速抽提試劑盒(上海生工生物工程有限公司)；瓊脂粉(上海藍季科技發展有限公司)；蛋白胨(北京奧博星生物技術有限公司)；磷酸氫二鉀(天津市凱通化學試劑有限公司)；硫酸鎂(上海強順化工有限公司)；硝酸鈉(成都市科龍化工試劑廠)；氯化鉀(西隴化工股份有限公司)。

1.2 主要儀器設備

TGL-16G 高速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)、CX31 生物顯微鏡(OLYMPUS 有限公司)、超凈工作臺(蘇凈集團安泰公司)、LS-30 壓力蒸汽滅菌器、THZ-92C 氣浴恒溫振蕩器、SPX-150B-Z 型生化培養箱(上海博迅實業有限公司醫療設備廠)、數顯恒溫水浴鍋(常州人和儀器廠)。

1.3 試驗方法

1.3.1 粗酶液制備

菌株接種于發酵培養基，28 ℃、200 r/min，培養72 h 后取發酵液12 000 r/min 離心10 min，制得上清液即為粗酶液。

1.3.2 木聚糖酶活力的測定

采用DNS 法測定木聚糖酶活力。75 μL 粗酶液(對照組粗酶液煮沸滅活)與675 μL 底物(1%木聚糖溶液)混勻，40 ℃水浴反應10 min，立即加入750 μL DNS 終止反應，沸水浴10 min 顯色，冷卻至室溫后，540 nm 波長測定吸光度。每組試驗設三個重復，取其平均值。

酶活力定義：在pH 值為7，40 ℃條件下，每分鐘水解1%木聚糖產生1 μmol還原糖的酶量為一個酶活力單位，以“U/mL”表示。

1.4 酶學特性

1.4.1 溫度對木聚糖酶相對酶活力的影響

測定粗酶液在20、30、40、50、60、70 ℃的木聚糖酶活力以確定酶的最適反應溫度。粗酶液在40、50、60、70 ℃保溫1 h后，40 ℃測定剩余木聚糖酶活力，確定酶的溫度穩定性。

1.4.2 pH值對木聚糖酶活力的影響

測定粗酶液在pH 值為4、5、6、7、8、9、10 條件下的木聚糖酶活力以確定酶的最適反應pH值。粗酶液與pH 值為4、5、6、7、8 的緩沖液1∶1 混勻，保溫1 h，40 ℃測定剩余木聚糖酶活力，確定酶的pH值穩定性。

1.4.3 金屬離子對木聚糖酶活力的影響

在酶的反應體系中分別加入10 mmol/L 的Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+，以不添加金屬離子為對照組，40 ℃測定木聚糖酶活力。

1.5 菌株發酵條件優化

1.5.1 營養條件對菌株產酶的影響

在初始發酵培養基基礎上，考察不同碳源[羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、葡萄糖、蔗糖、麩皮、木聚糖、玉米秸稈、玉米芯、花生秧]及碳源添加量(1%、2%、3%、4%、5%)對目標菌株產木聚糖酶活力的影響。考察不同氮源(尿素、硫酸銨、硝酸鈉、蛋白胨、酵母粉、豆粉)及氮源添加量(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%、4.0%)對目標菌株產木聚糖酶活力的影響。考察不同金屬離子(Na+、K+、Ca2+、Cu2+、Mn2+、Mg2+、Zn2+、Fe2+)及金素離子添加量(0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%)對目標菌株產木聚糖酶活力的影響。在28 ℃、200 r/min條件下振蕩培養72 h測定木聚糖酶活力。

1.5.2 培養條件對菌株產酶的影響

在發酵培養基上，分別考察培養溫度(18、23、28、33、38 ℃)、pH 值(5、6、7、8、9)、搖床轉速(170、200、230 r/min)、接種量(2%、4%、6%、8%、10%)對目標菌株產木聚糖酶活力的影響，恒溫振蕩培養72 h測定木聚糖酶活力。

1.5.3 營養條件優化正交試驗

在發酵條件優化結果基礎上，以最佳碳源、氮源、金屬離子為自變量，以酶活力為考察指標。每組試驗設3個重復，按照L9(34)正交表進行正交試驗。

1.5.4 菌株生長曲線和產酶曲線的測定

目的菌株在優化后的發酵條件下培養，每6 h 取樣稱重并測定木聚糖酶活力，繪制菌株的產酶曲線和生長曲線。

1.6 數據處理

用SPSS 20.0進行方差分析及差異顯著性分析。

2 結果

2.1 酶學特性研究

2.1.1 溫度對木聚糖酶相對酶活力的影響

以木聚糖酶相對酶活力最大值為100%。如圖1(A)所示，木聚糖酶最適反應溫度為50 ℃，在20～50 ℃之間相對酶活力隨溫度的升高而增大，在40～70 ℃之間相對酶活力保持在60%以上。

圖1 溫度對菌株SD10木聚糖酶相對酶活力的影響

如圖1(B)，木聚糖酶相對酶活力在40～50 ℃相對酶活力能保持在80%以上，說明此酶在與動物體溫接近的溫度下(40 ℃)有較好的穩定性，當溫度高于50 ℃時相對酶活力迅速下降。

2.1.2 pH值對木聚糖酶相對酶活力的影響

以木聚糖酶相對酶活力最大值為100%。結果如圖2(A)所示，在pH 值4～6 之間相對酶活力隨pH值的升高而增大，pH 值大于7 時相對酶活力快速下降。因此，該木聚糖酶相對酶活力最適反應pH 值為6。

圖2 pH值對菌株SD10木聚糖酶相對酶活力的影響

如圖2(B)所示，木聚糖酶相對酶活力在pH值4～8的范圍內有良好的穩定性，相對酶活力均在80%以上。

2.1.3 金屬離子對木聚糖酶相對酶活力的影響

以對照組木聚糖酶相對酶活力為100%。如圖3所示，Fe2+、Zn2+、K+對木聚糖酶相對酶活力有促進作用，Na+、Mg2+、Ca2+對木聚糖酶活力有較弱的抑制作用，Mn2+、Cu2+對木聚糖酶相對酶活力有較強的抑制作用。

圖3 金屬離子對菌株SD10木聚糖酶相對酶活力的影響

2.2 菌株SD10發酵條件的優化

2.2.1 碳源對菌株SD10產木聚糖酶活力的影響

菌株SD10利用麩皮、玉米秸稈、玉米芯、花生秧產木聚糖酶的能力優于葡萄糖、蔗糖、CMC-Na、木聚糖產木聚糖酶活力(見圖4)。麩皮為碳源時，木聚糖酶活力最高，其次是玉米秸稈和玉米芯；葡萄糖、蔗糖為碳源時，酶活力較低。因此，選取麩皮作為最佳碳源。

圖4 不同碳源對菌株SD10產木聚糖酶活力的影響

圖5 麩皮添加量對菌株SD10產木聚糖酶活力的影響

如圖5所示，麩皮的添加量由1%增加到3%時木聚糖酶活力逐漸增加，添加量為3%以后木聚糖酶活力逐漸下降。可能是由于麩皮濃度過大形成較厚的懸浮物，使麩皮與發酵液混合不均勻，影響營養物質的利用，降低發酵過程中的溶氧量，不利于發酵產酶[17]。因此，選3%為麩皮最佳添加濃度。

2.2.2 氮源對菌株SD10產木聚糖酶活力的影響

圖6 不同氮源對菌株SD10產木聚糖酶活力的影響

圖7 蛋白胨添加量對菌株SD10產木聚糖酶活力的影響

如圖6所示，蛋白胨為氮源時，菌株SD10產木聚糖酶活力最高，豆粉、硝酸鈉為氮源時酶活力次之。因此，選擇蛋白胨為最佳氮源。如圖7 所示，蛋白胨添加量由1%增加到3%時，木聚糖酶活力逐漸升高。添加量為3%時，木聚糖酶活力最高，添加量繼續增大，木聚糖酶活力下降。因此，選取3%為蛋白胨的最佳添加濃度。

2.2.3 金屬離子對菌株SD10產木聚糖酶活力的影響

圖8 不同金屬離子對菌株SD10產木聚糖酶活力的影響

如圖8 所示，培養基中添加Mn2+時，菌株SD10 產木聚糖酶活力最高，Mg2+、Na+次之。因此，選Mn2+為最佳金屬離子。

圖9 Mn2+的添加量對菌株SD10產木聚糖酶活力的影響

如圖9 所示，Mn2+的添加量為0.1%時，菌株SD10產木聚糖酶活力最高，因此，選取0.1%為金屬離子Mn2+的最佳添加濃度。

圖10 培養溫度對菌株SD10產木聚糖酶活力的影響

2.2.4 培養溫度對菌株SD10產木聚糖酶活力的影響如圖10 所示，培養溫度在18～33 ℃時，隨著溫度升高，木聚糖酶活力逐漸增大，33 ℃時酶活力達最高值，高于33 ℃后木聚糖酶活力下降。因此，選取33 ℃作為最佳培養溫度。

2.2.5 培養基初始pH 值對菌株SD10 產木聚糖酶活力的影響

圖11 初始pH值對菌株SD10產木聚糖酶活力的影響

如圖11所示，培養基初始pH值為5～8時，木聚糖酶活力隨pH 值增大而升高，在pH 值為8 時，木聚糖酶活力達到最大。因此，選擇pH 值8 為培養基初始pH值。

2.2.6 搖床轉速對菌株SD10產木聚糖酶活力的影響

圖12 搖床轉速對菌株SD10產木聚糖酶活力的影響

如圖12所示，隨著搖床轉速增加，木聚糖酶活力升高。搖床轉速為230 r/min 時，木聚糖酶活力最大。因此，選取230 r/min為培養時的搖床轉速。

2.2.7 接種量對菌株SD10產木聚糖酶活力的影響

圖13 接種量對菌株SD10產木聚糖酶活力的影響

如圖13 所示，接種量為2%時，木聚糖酶活力達到最高。接種量過大，菌體生長過快，代謝產物積聚抑制酶的合成，木聚糖酶活力持續下降。選取2%的接種量為最佳接種量。

2.2.8 營養條件優化正交試驗

以麩皮添加量(A)、蛋白胨添加量(B)、Mn2+添加量(C)為自變量，菌株SD10木聚糖酶活力為考察指標，進行正交試驗，按照L9(34)正交表設計（見表1），試驗結果如表2所示。

由正交試驗結果，通過R 值比較分析，對木聚糖酶活力的影響順序為C＞A＞B，Mn2+添加量(C)是對木聚糖酶活力影響最大的因素，最佳培養基配方為A1B1C1(麩皮添加量30 g/L、蛋白胨添加量20 g/L、Mn2+添加量0.5 g/L)。

表1 菌株SD10營養條件優化的正交試驗設計

表2 菌株SD10正交試驗結果

2.2.9 菌株生長曲線和產酶曲線的測定

圖14 菌株SD10的生長曲線和產酶曲線

如圖14 所示，菌株SD10 的生長時期分別為：0～30 h 為遲緩期，生長曲線較平緩，菌體數量較少；30～60 h 為對數期，菌體數量快速增多，菌體代謝旺盛；60～66 h為穩定期，菌體的數量達到最大值；66 h以后為衰亡期，菌體數量開始下降。菌株SD10 所產木聚糖酶在0～18 h 時木聚糖酶活力處于較低水平且增速較慢，18～78 h木聚糖酶活力快速增大，在84 h時達到最大值，90 h之后開始下降。

3 討論

木聚糖是半纖維素的主要成分，處于纖維素與木質素的交界處，維持纖維抱合力和細胞壁結構完整性[18]，所以木聚糖酶對木質纖維素的降解有重要作用。本研究選取菌株Neurospora crassa具有完整的木質纖維素降解酶系，能夠合成多種纖維素酶、半纖維素酶和木質素酶，同時可以避免由纖維二糖積累引起的反饋抑制[19-20]。Neurospora crassa不僅具備強大的蛋白質表達和分泌能力，菌體內還含有豐富的蛋白質、維生素B12和多種酶類，而且具有培養簡單，生長迅速，無霉菌毒素生成等優點[21-22]，因此可安全用于生產發酵。

本研究中Neurospora crassaSD10 木聚糖酶具有良好pH 值穩定性，在酸性和中性環境下都能維持80%以上的酶活力。經發酵條件優化后，菌株SD10最高酶活力達到9.4 U/mL，較初篩時提高了19.9 倍。在后續研究中可通過基因工程技術進一步提高木聚糖酶表達水平，改善木聚糖酶的酶學性質，為以后的工業應用奠定基礎。

4 結論

從青藏高原土壤中篩選得到一株高產木聚糖酶菌株Neurospora crassaSD10，對其進行產酶條件優化及酶學性質研究，結果表明，菌株SD10產酶的最佳條件為：麩皮30 g/L、蛋白胨20 g/L、Mn2+0.5 g/L、培養溫度33 ℃、轉速230 r/min、接種量2%、發酵時間84 h、初始pH值8.0。菌株SD10所產木聚糖酶的最適反應溫度為50 ℃，在40～50 ℃有較好的穩定性，能保持80%以上的酶活力。該酶最適反應pH 值為6.0，在pH 值4.0～8.0 之間酶活力穩定維持在80%以上；Fe2+、Zn2+、K+對酶活力有促進作用，Na+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Cu2+對酶活力有抑制作用。