分子檢測技術對結核性腦膜炎的診斷應用

李 櫻 綜述 單煜恒 審校

結核性腦膜炎(tuberculous meningitis，TBM)是一種由結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)感染腦膜引起的非化膿性炎癥，具有病死率高，發病年齡低等特點。即使經過規范化治療，依然有超過1/3的患者死亡，存活的患者也常遺留有多種神經系統后遺癥[1]。早期診斷和及時、規范的治療是改善TBM預后的重要手段。然而，由于臨床表現缺乏特異性、檢驗手段缺乏敏感性，部分患者在疾病早期難以得到準確診斷[2]。

診斷TBM的關鍵在于對腦脊液(cerebrospinal fluid，CSF)中Mtb的檢測，常規檢測方法包括涂片染色鏡檢法及Mtb培養法[3]。但這兩種常規方法耗時長且敏感度低，難以實現TBM的早期診斷[4]。隨著分子生物學技術的不斷發展，利用聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)技術擴增Mtb特異性堿基序列(探針法)、利用基因測序技術檢測微生物種類(測序法)等分子檢測技術逐漸應用于Mtb的實驗室檢測。以其標準化的操作流程，及時高效的診斷效能，這些分子檢測技術逐漸成為目前TBM實驗室診斷的研究熱點。本文將圍繞不同分子檢測技術在TBM診斷中的應用現狀和前景進行綜述。

1 Amplicor與COBAS TaqMan MTB技術

由瑞士Roche公司研發的Amplicor是首批應用于Mtb實驗室檢測的商業化試劑盒。該技術利用特異性引物選擇性擴增16S rRNA基因中一個長為584 bp 的DNA片段，再將擴增子與生物素標記的特異性探針雜交，進而利用酶聯免疫技術進行比色鑒定，當660 nm的吸光度值(OD660)>0.35時，判讀為Mtb陽性[5]。在2003年的一項研究中，作者發現以Mtb培養為金標準時，Amplicor診斷TBM的敏感度僅為55.6%，近半數患者呈現為假陰性。而當調整判讀閾值后(OD660>0.2)Amplicor的特異度又大幅下降。鑒于Amplicor技術在診斷效能中的缺陷，Roche公司在其基礎上開發了COBAS TaqMan MTB技術。該技術是首個基于TaqMan探針的診斷檢測方法。2011年，Kim應用Amplicor及COBAS TaqMan MTB技術對406個CSF樣本進行檢測，發現以Mtb培養陽性為金標準時，Amplicor診斷TBM的敏感度與特異度分別為58.3%與99.5%，而COBAS TaqMan MTB的敏感度與特異度分別為79.1%與98.2%[6]。這一結果提示，COBAS TaqMan MTB技術在TBM 診斷中具有較為理想的診斷效能及應用前景。

2 Mtb核酸直接擴增(amplified Mtb direct test，AMTD)技術

與Amplicor類似，由美國Gene-probe公司研發的AMTD技術也是一種早期應用于Mtb檢測的分子診斷技術。該技術使用轉錄酶擴增的方法擴增Mtb的16S rRNA，并利用吖啶脂標記的探針與擴增產物結合，從而進行化學發光檢測。由于rRNA在Mtb細胞中具有較高的拷貝數，因此AMTD技術也具有較高的敏感度。Chedore通過對311個CSF樣本進行檢測，發現以Mtb培養為金標準時，AMTD診斷TBM的敏感度與特異度分別為94%及99%。在另一項研究中，Lang等[7]發現AMTD在抗酸染色陰性的TBM患者中也具有良好的診斷效能，敏感度可達83%。該技術可在2.5 h內實現樣本中Mtb的快速檢測，且整個反應過程在單一溫度及反應管內進行，易于操作且不易污染。但是，由于rRNA只存在于活的Mtb細胞中，因此抗結核治療可能會影響AMTD的檢測結果。

3 環介導的等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術

LAMP技術是由日本Eiken Chemical公司研發的一種快速、簡便且有效的DNA擴增技術。該技術屬于恒溫擴增檢測技術的一種，僅需要2h即可完成對Mtb的鑒定[8]。LAMP可應用多種引物分子探針實現多個靶基因的擴增。其中，最常用的靶基因位點為IS6110，其次為MPB64。2011年，Nagdev[9]通過對27例TBM患者的CSF樣本進行檢測，發現以Mtb培養為金標準時，LAMP(IS6110)診斷TBM的敏感度為88%，特異度為80%。在另一項研究中，Modi等[10]通過對250例TBM患者及100例非TBM患者的CSF進行檢測，發現LAMP(IS6110)及LAMP(MPB64)診斷TBM的敏感度分別為87%及88%。上述結果提示LAMP對于TBM具有良好的診斷效能。但是，LAMP 技術也存在明顯不足。首先，應用于LAMP的引物分子探針設計較為復雜，且不同的引物分子探針的診斷效能不一。其次，LAMP的擴增產物常帶有核酸內切酶殘端，無法直接進行定量分析，只能對擴增片段的有無進行定性分析。

4 分子線性探針技術(molecular line probe assay，LPA)

LPA主要應用于多耐藥性Mtb的檢測。該技術使用能夠靶向擴增Mtb耐藥基因的特異性引物，將擴增子與生物素標記的分子探針雜交，利用化學顯色技術進行結果判讀。目前，應用LPA檢測Mtb的方法主要有兩種：靶向利福平(rifampin，RIF)耐藥基因rpoB的INNO-LiPA Rif TB Assay和靶向異煙肼耐藥基因katG、inhA的GenoType MTBDRplus[11]。2015年，Solomons等[12]檢測了GenoType MTBDRplus的診斷效能，發現以TBM臨床診斷為金標準時，該檢測技術的敏感度為33%，特異度為98%。雖然LPA對TBM診斷的敏感度并不理想，但是該技術對于Mtb耐藥性的檢測非常準確，敏感度與特異度均超過95%。

5 GeneXpert MTB/RIF技術

GeneXpert MTB/RIF(簡稱Xpert)技術是一種以全自動半巢式實時定量熒光PCR為基礎，rpoB基因為靶點，利用GeneXpert平臺自動提取DNA并擴增的一種分子檢測技術[13]。該技術應用5種相互重疊的引物分子探針，選擇性擴增與RIF耐藥相關的rpoB基因核心區域，從而實現對Mtb DNA及RIF耐藥性的同時檢測。它具有方便、快速等特點，約2 h即可讀取結果。結果判讀依靠探針的循環閾值，即Ct值。當不少于2個探針的Ct值≤38時，即可判讀為Mtb陽性，當探針的早期與晚期Ct值之差>3.5時，即提示Mtb對RIF耐藥[14]。自2009年由美國 Cepheid 公司研發以來，Xpert技術逐步應用于臨床，并于2010年及2013年先后經過世界衛生組織及美國藥品食品監督局批準，成為診斷TMB的一線方法[15]。

2014年，Denkinger等[16]在研究中發現，以Mtb培養陽性為金標準時，Xpert診斷TBM的敏感度超過80%，而以臨床診斷為金標準時，其敏感度也可達到60%。2018年，Kohli等[17]對33項關于Xpert診斷TMB的研究進行薈萃分析，發現Xpert診斷TMB的合并敏感度為71%、合并特異度為98%。自Xpert檢測系統得到國家食品藥品監督管理總局批準后，我國部分醫院也開展這一檢測技術，并發現以Mtb培養陽性為金標準時，其診斷TBM的敏感度約為80%，而以臨床診斷為金標準時，其敏感度約為50%[18-20]。上述結果提示，Xpert對于TBM的診斷具有良好的診斷效能。但是，價格高、通量小的特點限制其在基層醫院的廣泛應用。而且，早期應用該技術是否能夠改善TBM患者的總體預后還有待進一步研究。

6 Xpert MTB/RIF Ultra技術

Xpert MTB/RIF Ultra(簡稱Xpert Ultra)技術是在Xpert技術基礎上的發展與改進，兩者在檢測原理及操作流程等方面基本相同。而Xpert Ultra技術應用了更豐富的引物分子探針，不僅包括原有的4種靶向rpoB基因的引物分子探針，還包括2種靶向多拷貝序列IS6110和ISl081的引物分子探針。這一改動使Xpert Ultra具有較低的檢測閾值，從而提高了Mtb檢測的陽性率。2018年，Bahr[21]開展了一項包括129例TBM患者的診斷實驗，發現以Mtb培養、Xpert或Xpert Ultra陽性為金標準時，Xpert Ultra的敏感度為95%，高于Mtb培養及Xpert的敏感度，具有統計學差異。而在近期發表的一項前瞻性診斷實驗中，Donovan等[22]發現以Mtb培養陽性為金標準時，Xpert Ultra及Xpert診斷TBM的敏感度分別為59.5%及55.3%，而以臨床診斷為金標準時，兩者的敏感度分別為47.2%及37.6%，均未發現統計學差異。因此，Xpert Ultra技術在診斷TBM中是否優于Xpert技術尚需要進一步研究及薈萃分析。

7 宏基因組二代測序(metagenomic next-generation sequencing，mNGS)技術

mNGS技術是目前應用最為廣泛的基因測序技術，具有成本低、通量高、速度快等特點，能夠檢測樣本中微生物的全部遺傳信息。這種檢測技術不需要制備特異性的分子引物，無差別的對樣本中所含的全部病原體進行篩查，通過與基因庫信息比對，確定潛在的致病菌。理論上，mNGS在TBM的診斷中具有一定的應用前景。2019年，邢小微[23]在關于mNGS診斷中樞神經系統感染性疾病的研究中發現，當以Mtb培養或Xpert為金標準時，mNGS診斷TBM的敏感度為60%、特異度為96%。在同年的另一項相關的研究中，Wang等[24]得到了類似的結果，在該研究中mNGS診斷TBM的敏感度為66%。但是，mNGS在TBM診斷的應用中還存在諸多問題。首先，mNGS的檢測結果并不唯一，?？稍跈z測中發現其他致病微生物的存在，使得結果難以判讀；其次，標本提取、實驗室檢測等操作過程中可能帶來外源性核酸污染，使mNGS結果的可信性大為下降；再次，關于mNGS診斷TBM的研究不足，證據欠缺，也尚無相關指南及共識推薦。

近年來，隨著核酸擴增技術的發展與進步，應用于診斷TBM的分子檢測技術層出不窮。這些檢測技術具有快速、可重復及高通量等優點，但是也存在很多問題亟待解決。首先，CSF的低含菌量問題不僅影響傳統檢測方法的Mtb檢出率，也影響分子檢測技術的Mtb檢出率。增加CSF樣本含量并在檢測前離心處理可能對于提高分子檢測技術的敏感性有一定作用，但尚需相關研究證實。其次，診斷TBM的金標準尚有爭議，而且相關研究對金標準的選擇并不一致。不同的金標準選擇會得到分子檢測技術不同的診斷效能。比如，應用Mtb培養為金標準時，可能會高估分子檢測技術的敏感度并低估其特異度；而應用臨床診斷為金標準時，則可能會低估分子檢測技術的敏感度并高估其特異度。第三，分子檢測技術較傳統的Mtb檢測方法更為昂貴，而且在基層醫院難以開展。

雖然存在以上不足，但是分子檢測技術的出現與發展已將Mtb的檢測從細胞水平提升至分子水平。在今后的研究中，如何降低檢測費用并提高分子檢測技術的診斷效能將成為相關領域的熱點問題。另外，建立一套全面的臨床應用綜合評價系統也將有助于分子檢測技術在TBM臨床診斷中的進一步應用與開展。