新疆絕經后女性2型糖尿病LRP5基因rs3736228、rs3781586位點的基因多態性及突變與糖、脂、骨代謝關系的研究

王曦齡 李 軍 李思源 高 群 王 雙

1 新疆石河子大學醫學院第一附屬醫院內分泌代謝科(石河子 832000) 2 新疆石河子大學醫學院(石河子 832000) 3 上海楊浦區中心醫院(上海 200000)

2型糖尿病(type 2 diabetes, T2DM)是由多種病因引起的一組以胰島素抵抗、胰島素分泌不足引起糖代謝紊亂、長期高血糖狀態為主要表現的臨床綜合征[1]。T2DM 是一種具有復雜病因的綜合癥，其發病與種族人群、先天遺傳及環境改變、膳食結構相關[2]。而糖尿病合并骨質疏松(osteoporosis，OP)近年來頻繁出現在糖尿病合并慢性并發癥患者的關注中。它以骨量降低、在持續病因影響下無法維持正常骨小梁等骨組織微結構、進一步加劇骨的脆性，造成骨折等意外事件為特征的全身代謝性疾病。這是老年人骨折最常見的原因。統計數據表明，骨質疏松發生率在老年人和絕經后女性中明顯增高。其中，骨密度(BMD)下降是脆性骨折的主要原因[3]。在骨質疏松的眾多致病條件中，遺傳一直是國內外專家關注的重要因素[4]。近年來國內外專家致力于發現并研究骨質疏松癥候選基因的推想與實驗，同時，一部分研究結果提示了在原發性骨質疏松復雜的病理機制中，遺傳因素即基因多態性或基因突變占有重要地位，證實基因多態性在原發性骨質疏松病因中起了重要作用[5- 6]。女性絕經后發生骨質疏松主要原因是卵巢衰老功能降低，雌激素分泌低水平，成骨細胞功能減弱或降低，破骨細胞數目增加，兩者之間失去正常的平衡狀態，加速成骨細胞凋亡，引起骨轉移、骨吸收加強，造成骨量減少發展成骨質疏松。糖尿病作為一種由遺傳和環境等復雜多因素相互作用而引起的物質代謝性紊亂疾病，國內外多項研究證實了糖尿病患者存在脂質代謝異常，并同時提出了糖尿病性骨質疏松癥等亞臨床疾病狀態[7]。本研究將對新疆石河子地區2型糖尿病絕經后女性LRP5基因該兩個位點基因多態性及突變與糖、脂、骨代謝關系，為新疆絕經后女性2型糖尿病合并骨質疏松的防治提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料與診斷標準

從新疆石河子地區2016年10月—2017年10月社區及住院的絕經后女性中選取入組對象，根據患者病史、糖耐量試驗及骨密度測定結果分為四組：糖耐量正常與骨量正常組(A組)，糖耐量正常與骨量異常組(B組)，T2DM與骨量正常組(C組)，T2DM與骨量異常組(D組)。該研究在醫學倫理委員會的監督下，入組人員皆簽字知情同意文書后開展本實驗。

其中T2DM的診斷標準符合1999年WHO推薦的診斷標準。BMD的判斷標準符合1994年WHO推薦的診斷標準。血液標本及信息收集均獲患者的知情同意。納入無特殊原因絕經后、完全行事能力人、神志清、說話流暢的女性；排除患有特殊類型糖尿病及1型糖尿病及其他引起骨質疏松等疾病的女性。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床生化指標的測定：由實驗研究員使用調查問卷形式記錄入組對象的姓名、年齡、絕經年限、糖尿病病史、骨質疏松癥及其他代謝性疾病病史，采用統一標準對研究對象進行身高、體質量、腰圍、臀圍等資料的測量并登記。按照體質量指數(body mass index, BMI),等于體質量除身高平方(kg/m2)得到體質量指數，及計算腰圍與臀圍的比值，得到腰臀比。

1.2.2 一般生化指標的測定：選取1管靜脈血采用羅氏全自動生化分析儀(型號Modular DPP-H7600)測定： FPG 等糖代謝指標；測定TG、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)等脂代謝指標；測定血Ca、血P、ALP等骨組織代謝指標；同時，高壓液相色譜法(HPLC)測定糖化血紅蛋白(HbAlc)數值。雙能X線吸收法測定腰椎1- 4及股骨頸骨密度(BMD)。

1.2.3 LRP5基因DNA提取：采用受試者外周血5 mL，提取DNA的步驟按照天根生化科技有限公司使用說明，全血基因組DNA提取試劑盒，- 80 ℃保存備用。

1.2.4 Sequenom飛行時間質譜法測定LRP5基因rs3736228、rs3781586多態性：首先在UCSC網站查閱到SNP數據庫上關于LRP5基因該兩個位點的堿基序列和長度。順利完成引物設計是需要Assay Design 3.0 Software(Sequenom Mass 公司)生物技術對兩個位點設計引物，(具體引物序列如下)。打開PCR檢測儀，設置PCR各項步驟；使用Sequenom飛行時間質譜法測定LRP5基因rs3736228、rs3781586的基因突變情況。步驟：引物設計，PCR擴增反應，PCR產物純化，單堿基延伸反應，上機檢測。以下為具體引物序列：

rs3736228:上游引物(F):5′-AGTGCGATGACCAGAGCG- 3′

下游引物(R):5′-TGGTGGGACAGGATGGGTG- 3′

Rs3781586:上游引物(F):5′-CCGTAAGCAGAGGGGACATT- 3′

下游引物(R): 5′-ATGGCACTGCTGAGGTGACTGT- 3′

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1.1 組間基線情況的比較 A、B、C、D四組研究對象的年齡、絕經年限、體質量指數、腰臀比等一般觀察情況，見表1。

表1 組間基線情況比較

與A組比較，B組及D組的年齡(B組P=0.046；D組P=0.001)及絕經年限(B組P=0.027,<0.05；D組P=0.006,<0.01)均大于A組，差異有統計學意義，一般基線資料不齊，故采用協方差分析除外年齡及絕經年限對以下結果的影響。

2.1.2 組間糖代謝、骨代謝、脂代謝生化指標的比較 經協方差分析后A、B、C、D四組研究對象的FBG、HbAlc、TG、HDL-C、LDL-C、Ca、P、ALP、L1- 4BMD、股骨頸BMD等各項觀察指標，見表2。

表2 組間生化指標經協方差分析后的比較

組間糖、脂、骨代謝及骨密度(BMD)指標比較結果：與A組比較，C組、D組的糖代謝指標FPG(C組P=0.005；D組P=0.001)、HbA1c(C組P=0.001；D組P=0.001)水平較高；B組、D組中脂代謝指標TG(B組P=0.038;D組P=0.046)水平較低；B組、D組BMD(L1- 4)(B組P=0.001;D組P=0.009)、BMD(股骨頸)(B組P<0.001;D組P=0.003)水平較低。

2.2 LRP5基因rs3736228、rs3781586的基因多態性及基因突變分析

2.2.1 Hardy-Weinberg遺傳平衡吻合度檢驗：本研究中，與病例組相比，對照組人群更接近自然人群，故僅在對照組人群中進行遺傳平衡檢驗。新疆石河子地區絕經后女性該兩個位點基因型A組經過遺傳平衡檢驗結果：rs3736228位點：χ2=0.629，P=0.427；rs3781586位點χ2=0.465，P=0.495。說明本研究所選擇的研究人群能夠代表目標人群，具有較好的人群代表性。

2.2.2 LRP5基因組間基因型及等位基因分布頻率：新疆石河子地區絕經后女性該兩個位點組間基因型及等位基因分布頻率未發現統計學差異(P>0.05)。

2.3 LRP5基因突變與骨、糖、脂代謝的關系

2.3.1 不同組間LRP5基因rs3736228位點不同基因型之間代謝指標的比較：由于TT型的研究對象少，所以將TT型與CT型整合成TT/CT(突變型)后與CC型(野生型)比較分析。A組LRP5基因rs3736228位點基因型之間基線指標的比較(P>0.05)，基線齊同，具有可比性。A組，與CC型(野生型)相比， CT/TT型(突變型)甘油三酯(TG)降低(P=0.026)，BMD(L1- 4)降低(P=0.046)；其他各項代謝指標差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。C組LPR5基因rs3736228位點基因型之間基線指標的比較(P>0.05)，基線齊，有可比性。C組，與CC型(野生型)相比，CT/TT型(突變型)高密度脂蛋白(HDL-C)升高(P=0.003)，磷(P)升高(P=0.038)；其他各項代謝指標差異無統計學意義(P>0.05)，見表4。B組中各項代謝指標差異無統計學意義(P>0.05)。D組中各項代謝指標差異無統計學意義(P>0.05)。

表3 A組LRP5基因rs3736228基因型之間骨、糖、脂代謝指標的比較

表4 C組LRP5基因rs3736228基因型之間骨、糖、脂代謝指標的比較

2.3.2 不同組間LRP5基因rs3781586位點不同基因型之間代謝指標的比較：由于TT型的研究對象少，所以將TT型與GT型整合成TT/GT(突變型)后與GG型(野生型)比較分析。B組LRP5基因rs3781586位點基因型之間基線指標的比較(P>0.05)，基線齊，有可比性。B組，與GG型(野生型)相比，GT/TT(突變型)高密度脂蛋白(HDL-C)升高(P=0.038)；其他各項代謝指標差異無統計學意義(P>0.05)，見表5。A、B、D組中各項代謝指標差異無統計學意義(P>0.05)。

表5 B組LRP5基因rs3781586基因型之間骨、糖、脂代謝指標的比較

3 討 論

依據最新的中國流行病學調查可知，國人糖尿病總患病率高達9.7%，平均每10個中國人便有1個是糖尿病患者。糖尿病合并骨質疏松癥發病率已達到60%以上，該病受包括遺傳、環境、吸煙、過量飲酒、低鈣飲食等多種因素在內的影響，在發病趨勢上存在隨著年齡增加而增加的特征[8]。隨著人口老齡化進程逐漸加速，年齡因素在骨質疏松癥中的發生、發展的影響日益突出，老年人患病率顯著增加，OP及骨質疏松性骨折已成為現代社會不可忽視的公共健康衛生問題。兩者起病隱匿，無論是長期高血糖狀態還是骨量降低，臨床癥狀不明顯，患者無法及時醫院就診，明確診斷，造成治療延誤錯過最佳時機[9]。人類低密度脂蛋白受體相關蛋白5基因在染色體上的位置為11q12-13，LRP5基因表達產物為跨膜受體蛋白[10]，目前國內外多項研究證實LRP5基因與T2DM、OP相關，也有研究提出LRP5作為共受體參與WNT經典信號通路調節骨代謝的機制假設[11]。故國內外學者考慮將LRP5基因的多態性及突變作為參與2型糖尿病性骨質疏松癥代謝性轉導信號通路中備選基因之一[12]，而LRP5基因多態性及突變與2型糖尿病及2型糖尿病性骨質疏松癥的研究在國內外報道尚不明確。

在探討LRP5基因與T2DM及OP的關系中，通過高通量時間飛行時間質譜法檢測，發現新疆石河子地區絕經后女性2型糖尿病LRP5基因rs3736228、rs3781586位點高頻等位基因頻率分別是：0.786和0.814，這與日本、韓國等亞洲蒙古人種保持一致，而與白種人卻存在明顯的差異性。同時，發現該兩個位點基因型分組中野生型純合子基因型最多，突變型雜合子基因型次之，突變型純合子基因型最少。本研究中將對照組與病例組相比，糖耐量正常與骨量正常組人群更接近理想自然人群，故使用遺傳平衡檢驗對照組人群的遺傳性情況。本研究發現新疆石河子地區絕經后女性群體該兩個位點基因頻率和基因型頻率的遺傳規律基本符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。說明本研究所選擇的研究人群具有相對穩定的遺傳性，能夠較好的代表目標人群。與正常對照組(即糖耐量正常伴骨量正常組)相比，T2DM伴骨量正常組、糖耐量正常伴骨量異常組、T2DM伴骨量異常組位點基因型頻率分組無統計學差異(P<0.05)。研究結果提示，該兩個位點的基因多態性可能與新疆絕經后女性糖代謝紊亂沒有關聯。但本研究發現LRP5基因該兩個位點在絕經后女性中的基因突變可能與TG水平降低、HDL水平升高、P水平升高、BMD水平降低有關，進一步說明LRP5基因該兩個位點的基因的突變可能與該地區人群中脂、骨代謝有關，參與了2型糖尿病患者脂代謝紊亂及合并OP的發生發展。

目前2型糖尿病合并OP是一種常見病、多發病，尤其是在絕經后女性中發病機制的研究尚不明確。本研究表明LRP5基因在糖代謝、骨代謝中扮演著重要角色，該基因rs3736228、rs3781586位點的突變在新疆石河子絕經后2型糖尿病女性中可能參與了骨質疏松、脂代謝紊亂的發生、發展，關于Wnt信號通路相關蛋白LRP5的基因多態性突變，在未來的實驗研究中還需進一步擴大人群范圍，全面篩查影響基因的其他因素，從而通過較為先進的實驗室測量方法及完善的統計學分析來揭示LRP5基因多態性與疾病之間的關系，為糖尿病合并骨質疏松的防治提供新的理論依據。