山茱萸炮制前后的UPLC特征圖譜研究

林碧珊，陳錦霞，史紫娟，陳科成，曾杉

（國藥集團廣東環球制藥有限公司，廣東佛山528305）

山茱萸（Cornus officinalisSieb.et Zucc.）是山茱萸科山茱萸屬植物的成熟干燥果肉［1］，主產于我國安徽、陜西、浙江、河南等省。山茱萸具有補益肝腎、澀精固脫的作用，主要用于眩暈耳鳴、腰膝酸痛、陽痿遺精、遺尿尿頻、崩漏帶下、大汗虛脫、內熱消渴等癥［2?4］。山茱萸的主要成分包括環烯醚萜苷類、有機酸及其酯類、五環三萜類、鞣質、多糖等，主要的苷類成分有山茱萸苷、莫諾苷、馬錢苷、獐牙菜苷及山茱萸裂苷等，其中莫諾苷和馬錢苷是山茱萸中最主要的環烯醚萜苷類成分［5?7］。

目前，《中國藥典》中尚無區分山茱萸生品和炮制品的鑒別內容，而文獻對山茱萸的研究多集中在其化學成分、藥理作用及含量測定上，對炮制前后藥材指紋圖譜的差異沒有系統分析方法，不能完整反映真實質量，缺乏綜合有效的評價標準［8］。采用中藥指紋圖譜可以較全面反映中藥材及其飲片所含成分的真實情況，適用于中藥的鑒別和質量控制，本研究通過考察不同產地山茱萸炮制前后特征圖譜的變化，為山茱萸飲片在加工炮制過程中的質量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

H?class UPLC高效液相色譜儀（PDA二極管陣列檢測器，美國Waters公司）；AL104型電子天平（梅特勒?托利多公司）；KQ?500DE型數控超聲清洗儀（昆山超聲儀器有限公司）；M MILLIPORE Syner?gy UV超純水儀（美國默克公司）。

1.2 試藥

對照品：莫諾苷（中國食品藥品檢定研究院，批號：111998?201602）；馬錢苷（中國食品藥品檢定研究院，批號：111640?201707）；沒食子酸（中國食品藥品檢定研究院，批號：110831?201605）；5?羥甲基糠醛（中國食品藥品檢定研究院，批號：110998?201608）；甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純，其他試劑均為市售分析純。

1.3 樣品

17批山茱萸藥材分別從河南、陜西、浙江、安徽等不同產地購得，經國藥集團廣東環球制藥有限公司按《中國藥典》2015年版檢驗均合格，將檢驗合格的17批藥材嚴格按照《中國藥典》2015年版一部酒萸肉飲片項下規定炮制成酒萸肉飲片。17批山茱萸生品、炮制品信息見表1。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適應性

色譜柱：CORTECS T3柱（100 mm×2.1 mm，1.6μm）；以乙腈為流動相A，0.2%磷酸溶液為流動相B進行梯度洗脫（0～3 min，2%→8%A；3～9 min，8%→15%A；9～13 min，15%→25%A；13～16 min，25%→100%A；16～19 min，100%A；19.1～23 min，2%A）；柱溫：35℃；流速：0.3 mL/min；檢測波長：260 nm；進樣量：1μL；理論塔板數按馬錢苷峰計算應不低于10 000。

表1 17批山茱萸生品、炮制品樣品信息Table 1 The Information about 17 batches of Cornusofficinalis Sieb.et Zucc of hygiene and processed products

2.2 對照品溶液的制備

取莫諾苷對照品和馬錢苷對照品適量，精密稱定，分別加80%甲醇（體積分數，下同）制成每1 mL各含50μg的混合溶液。取沒食子酸對照品適量，精密稱定，加入70%甲醇（體積分數，下同）制成每1 mL含0.5 mg的對照品溶液。取5?羥甲基糠醛對照品適量，精密稱定，加入70%甲醇制成每1 mL各含0.1 mg的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取本品粉末（過三號篩）約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇（體積分數，下同）20 mL，密塞，稱定質量，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，用50%甲醇補足減失的質量，搖勻，離心，濾過，棄去初濾液，取續濾液即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性考察 精密稱取山茱萸生品和山茱萸炮制品各1份，按“2.3”項方法制備供試品溶液，與空白溶劑按“2.1”項色譜條件進樣測定，色譜圖見圖1。可見，空白溶劑對測定無干擾。

2.4.2 精密度試驗 精密稱取山茱萸生品1份，按“2.3”項方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件連續進樣6次，以峰4（馬錢苷）為參照峰，以共有峰的相對保留時間和相對峰面積為指標計算RSD值，結果均小于2.0%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩定性試驗 精密稱取山茱萸生品1份,按“2.3”項方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件分別在0、2、4、8、12、16、20、24 h進樣檢測，以峰4（馬錢苷）為參照峰，以共有峰的相對保留時間和相對峰面積計算RSD值，結果均小于1.0%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

A.空白溶劑;B.山茱萸藥材;C.酒萸肉飲片。圖1專屬性考察色譜圖Figure 1 The chromatograms of specificity

2.4.4 重復性試驗 精密平行稱取山茱萸生品6份，按“2.3”項的方法平行制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件進行測定，以峰4（馬錢苷）為參照峰，以共有峰的相對保留時間和相對峰面積計算RSD值，結果均小于2.0%，表明方法重復性良好。

2.5 山茱萸生品特征圖譜共有模式建立及分析

2.5.1 特征圖譜的建立 吸取“2.2”項對照品溶液和“2.3”項供試品溶液各1μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖2。經與對照品進行比較，確認峰1為沒食子酸，峰2為5?羥甲基糠醛，峰3為莫諾苷，峰4為馬錢苷。

2.5.2 山茱萸生品特征圖譜共有模式建立 取“1.3”項17批不同來源的山茱萸生品，按“2.3”項方法制備供試品溶液，再按“2.1”項色譜條件進行測定，將實驗數據導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）”，設定S1為參照圖譜，將各色譜峰匹配，建立特征圖譜，分析17批樣品的圖譜，選擇5個峰面積穩定且分離度好的色譜峰，確定其為共有指紋峰，17批山茱萸生品UPLC特征圖譜共有模式圖見圖3。

2.6 山茱萸炮制品特征圖譜共有模式建立

取“1.3”項下的17批不同來源的山茱萸炮制品，按“2.3”項方法制備供試品溶液，再按“2.1”項色譜條件進行測定，將實驗數據導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）”，設定S1為參照圖譜，將各色譜峰匹配，建立特征圖譜，分析17批樣品的圖譜，選擇5個峰面積穩定且分離度好的色譜峰，確定其為共有峰，17批山茱萸炮制品UPLC特征圖譜疊加圖譜見圖4。17批山茱萸生品、炮制品的對照圖譜比較圖見圖5。

圖2 對照品及山茱萸生品色譜圖Figure 2 The chromatograms of control substance and Cornus officinalis Sieb.et Zucc of hygiene products

圖3 17批山茱萸生品特征圖譜共有模式Figure 3 The common pattern of 17 batches of Cornus offici?nalis Sieb.et Zucc of hygiene products

2.7 山茱萸炮制前后相似度分析

將17批山茱萸生品和炮制品圖譜導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）”，以山茱萸生品圖譜為參照圖譜，進行峰匹配，計算得到山茱萸生品和炮制品圖譜之間的相似度；同時以峰4（馬錢苷）為S峰，計算峰2（5?羥甲基糠醛）的相對峰面積，結果見表2。可見，17批山茱萸炮制品與生品的相似度結果在0.754～0.994之間，表明山茱萸炮制前后色譜峰的構成具有較高的相似性，用相似度無法區分山茱萸生品和炮制品；同時計算生品和炮制品峰2的相對峰面積；結果17批山茱萸生品峰2的相對峰面積在0.044～0.122之間，而炮制品峰2的相對峰面積在0.284～3.302之間，兩者有明顯的差異，表明山茱萸炮制后5?羥甲基糠醛（峰2）較生品明顯增大，可通過峰2的相對峰面積比值加以區分生品與炮制品。

圖4 17批山茱萸炮制品特征圖譜共有模式Figure 4 The common pattern of 17 batches of Cornus officinalis Sieb.et Zucc of processed products

圖5 山茱萸生品、炮制品對照特征圖譜Figure 5 The control chromatograms of Cornus officinalis Sieb.et Zucc of hygiene and processed products

3討論

考察了檢測波長（210、240、260 nm）、流動相系統（乙腈?0.2%磷酸、乙腈?0.1%磷酸、乙腈?0.1%甲酸溶液、乙腈?0.1%乙酸）及柱溫（30、35、40℃）的分離效果，結果以檢測波長為260 nm、流動相系統為乙腈?0.2%磷酸及柱溫為35℃時的分離效果較好。比較提取溶劑（水、50%甲醇、80%甲醇、甲醇、乙醇）、提取方式（超聲提取、回流提取）及提取時間（30、45、60 min）的提取效果，結果以提取溶劑為50%甲醇、提取方式為超聲提取及提取時間為30 min時的提取效果較好。

表2 山茱萸炮制前后相似度和相對峰面積結果Table 2 Similarity and Relative peak area of Cornusofficinalis Sieb.et Zucc of processed products and hygiene products

中藥材在炮制過程可提高或降低藥材中化學成分的含量，甚至可使某些化學成分消失或產生新物質，本研究的山茱萸藥材經過炮制后化學成分的含量發生變化，其中5?羥甲基糠醛含量大幅度增加，呈10倍增加趨勢，說明炮制程度越強其含量變化越大，可用于區分山茱萸生品和炮制品，也可用于指導山茱萸藥材的炮制。本文結果為山茱萸炮制品的質量標準制定、品質評價提供了一定的科學依據，也為山茱萸生品和炮制品的質量控制提供了參考方法。