離子色譜法測定糊精中的5種還原糖

李藝，王淼

（廣東省藥品檢驗所，廣東廣州510006）

糊精系由淀粉或部分水解的淀粉，在干燥狀態下經加熱改性而制得的聚合物[1]。糊精通常分為白糊精、黃糊精和英國膠三類。白糊精隨著轉化作用的進行，還原糖穩定地上升到最高值，在轉化作用的后期，還原糖增加的速度較緩慢；黃糊精和英國膠，當黏度開始下降時還原糖含量開始減少，因此，還原糖是反映淀粉水解程度的關鍵指標。在制藥工業中，糊精作為藥用輔料主要用于片劑和膠囊劑的稀釋劑，片劑的黏合劑，糖包衣的增塑劑和黏合劑，以及混懸劑的增稠劑[2]，用量大，輔料的還原性可能影響制劑中原料藥的活性。因此有必要對糊精中還原糖進行控制。

糊精收載于《中國藥典》2020年版四部[1]，利用還原糖對堿性酒石酸銅的還原性，采用重量法進行測定；《美國藥典》和《英國藥典》中也收載了糊精，采用滴定法對還原糖進行控制，原理與《中國藥典》相同，該法僅能分析還原糖的總量。目前，文獻報道測定還原糖和總糖的方法主要有高效液相色譜法[3?4]、比色法[5]及紫外可見法[6]等。上述方法大多存在需要前處理，分析效率低，或者選擇性較差的不足。而離子色譜法利用其優異的陰離子交換色譜柱的分離技術，脈沖安培檢測器所具有的優勢，在糖類物質的檢測中得到越來越多的應用，可以很好地彌補上述不足。因此，本研究參考文獻[7]，采用操作較為簡單快速且專屬性較高的離子色譜法首次測定糊精中還原糖，為糊精的質量控制提供一個簡便而有效的方法。

1 儀器與試藥

ICS?5000+DC離子色譜儀，Thermofisher，主要配置在線脫氣裝置的四元梯度泵、柱溫箱、脈沖安培檢測器（Au為工作電極，Ag/AgCl為參比電極）；D?葡萄糖（中國食品藥品檢定研究院，批號110833?201707，質量分數：99.5%）；麥芽糖（中國食品藥品檢定研究院，批號：100287?201604，質量分數：94.4%）；麥芽三糖（中國食品藥品檢定研究院，批號：100274?201703）；麥芽四糖（上海源葉生物科技有限公司，批號：Z04J9X52064，質量分數：98%）；麥芽五糖（中國食品藥品檢定研究院，批號：112017?201602，質量分數100%）；糊精樣品（A企業：180108C、180306B；B企業：180212、180301；C企業：171201；D企業：160314）；試劑均為分析純；純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜儀：ICS?5000+DC離子色譜儀；檢測器：脈沖安培檢測器（Au為工作電極，Ag/AgCl為參比電極）；色譜柱：Dionex CarboPac PA200分析柱（250 mm×5 mm），Dionex CarboPac PA200保護柱（50 mm×5 mm）；流速：0.4 mL/min；柱溫：30℃；進樣量：25μL；以純化水流動相A，0.25 mol/L NaOH溶液為流動相B，0.25 mol/L醋酸鈉溶液為流動相C，按表1進行梯度洗脫。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備

取本品約0.1 g，精密稱定，置100 mL量瓶中，加水適量，搖勻，稀釋至刻度，作為供試品溶液，濾過（0.22μm微孔濾膜）。

2.2.2 對照品溶液的制備

精密稱取D?葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖和麥芽五糖適量，加水稀釋成每1 mL中含D?葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖和麥芽五糖各100μg的溶液作為對照品儲備液。精密量取對照品儲備液5 mL，置50 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，作為對照品溶液。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

2.3 屬性及系統適用性

取對照品溶液與空白溶液，精密量取25μL，分別注入離子色譜儀，按“2.1”項色譜條件進行測定，記錄色譜圖見圖1?？梢姡珼?葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖和麥芽五糖的保留時間分別為7.2、19.8、23.4、27.4、30.3 min，分離度均大于1.5，空白溶劑無干擾。

2.4 線性關系的考察

分別精密量取“2.2.2”項下的對照品儲備液加水稀釋成含D?葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖和麥芽五糖質量濃度分別為0.1、1、2、5、10、20μg/mL的系列溶液，作為線性溶液。按“2.1”項色譜條件測定。以對照品質量濃度作橫坐標（X）、峰面積作為縱坐標（Y），得到各成分測定的線性方程、相關系數及線性范圍見表2。

2.5 檢出限和定量限的考察

精密量取“2.2.2”項下的對照品儲備液適量，加水定量稀釋制成每1 mL中含D?葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖和麥芽五糖各約0.01μg的溶液，作為限度溶液。按“2.1”項色譜條件測定，記錄色譜圖，計算信噪比，以基線噪音3倍和基線噪音10倍分別計算檢出限及定量限，各成分的檢出限及定量限見表2。

2.6 精密度試驗

取“2.2”項下對照品溶液各6份，連續進樣測定，結果測得D?葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖和麥芽五糖的峰面積RSD值分別為0.8%、0.5%、0.9%、0.7%和0.8%，表明方法精密度良好。

2.7 穩定性試驗

取“2.2.1”項供試品溶液，分別于0、2、8、12、24、48 h時進樣，記錄色譜圖，測定峰面積值。結果表明各成分峰面積均無顯著性變化，RSD值均小于2.0%，表明供試品溶液在48 h內穩定。

2.8 重復性試驗

取A企業樣品（批號：180108C），按“2.2.1”項方法配制供試品溶液，共6份，分別進樣記錄色譜圖，結果測得葡萄糖、麥芽糖、麥芽二糖、麥芽三糖、麥芽四糖和麥芽五塘的RSD分別為1.2%、2.3%、0.8%、1.8%和1.9%，表明方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗

取A企業樣品（批號：180108C）約0.05 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，分別精密加入“2.2.2”項下對照品儲備液4、5、6 mL，再按“2.2.1”項方法制備低、中、高3個回收濃度的供試品溶液，各3份，共9份，按“2.1”項色譜條件進樣測定，計算回收率，結果測得D?葡萄糖平均回收率為98.4%，RSD為0.5%；麥芽糖平均回收率為99.2%，RSD為0.3%；麥芽三糖平均回收率為100.9%，RSD為1.1%；麥芽四糖平均回收率為98.9%，RSD為1.0%；麥芽五糖平均回收率為99.1%，RSD為0.8%，詳見表3。

圖1 空白對照溶液（A）、對照品溶液（B）和供試品溶液（C）的離子色譜圖Figure 1 Chromatograms of the black(A),reference standard(B)and sample(C)

2.1 0 樣品測定

取4個不同廠家共6批樣品，按“2.2”項下方法制備對照品溶液與供試品溶液，進樣，按“2.1”項下色譜條件測定，按外標法以峰面積計算。同時按《中國藥典》方法進行還原糖測定遺留殘渣，各樣品測定結果見表4。

表2 各成分的線性方程與線性范圍及檢出限和定量限Table 2 The linear equation,linear range,detection limit and quantitative limit of each component

表3 糊精中5種還原糖的回收率試驗結果Table3 Resultsofrecoveryoffivereducingsugarsindextrin

表4 不同廠家樣品中5種還原糖的測定結果Table 4 The results of determination of five reducing sugars in dextrin w/%

3 討論

在糊精的干法轉化過程中，淀粉發生的化學反應比較復雜，主要包含水解反應、苷鍵轉移反應、再聚反應。酸可催化斷裂淀粉中的α?1,4糖苷鍵，也可能斷裂α?1,6糖苷鍵[8]，苷鍵水解形成的還原性端基量增加，還原性增加。糊精中所含還原糖是混合物，水解反應生成含有游離醛基或酮基的葡萄糖單糖和含有游離醛基的麥芽糖，因而具有一定的還原性。此外，糊精還可能水解出麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖等，也具有一定的還原性基團。因此，本研究選擇上述5種糖進行檢測，結果顯示糊精中確實存在上述5種糖。本研究可以定量分析糊精水解出的葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖和麥芽五糖的含量，可為該檢查項提供具體量化數據，為分析糊精中的還原成分起到了巨大作用。

糊精在《中國藥典》中的還原糖檢查項采用重量法，通過測得氧化亞銅殘渣的量，從而判斷糊精中還原糖總量。根據《中國藥典》中的方法，對4個廠家的6批樣品進行檢測，遺留殘渣量分別為6.60%、3.08%、3.88%、6.08%、9.65%和0.64%。該結果對比本研究建立的離子色譜法檢測結果可以看出，2種檢測方法得到的結果趨勢性一致，重量法檢驗得到遺留殘渣多的供試品采用離子色譜法檢測時的測定結果也較大；另外，對比兩種方法得到的結果還發現重量法的結果均大于離子色譜法的檢測結果，原因分析一方面是重量法得到的結果是糊精中存在的還原性物質總量，可能會有與堿性酒石酸銅試液反應生成沉淀的其他物質，另一方面可能是由于離子色譜法測得的結果是由葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖相加的總量，糊精中可能還存在其他還原糖或者還原性物質。

在試驗中發現，重量法影響結果的因素較多，如煮沸反應時間、過濾、洗滌、干燥等步驟都可能對結果造成影響，重復性較差；而離子色譜法簡單快速且專屬性較高，排除了人為操作對結果的影響。

本研究參考離子色譜?積分脈沖安培檢測法測定β?環糊精中的有關物質[7]中的色譜條件建立了檢測方法，通過試驗表明，方法靈敏度高、準確性好，樣品制備簡單，所測成分之間的分離度良好，可準確檢測糊精中不同還原糖的含量，為糊精的質量控制提供了一個簡便而有效的方法，同時也在其他高分子多糖化合物的還原糖含量測定中具有廣闊的應用前景。