龍脷葉水提取物對哮喘大鼠肺組織病理學及炎癥因子的影響

陳素雯，魏嘉寶，邱思娃，李苑新，蔡延渠，吳燕紅

（1.廣東藥科大學新藥研發(fā)中心，廣東廣州510006；2.高州中醫(yī)院藥學部，廣東高州525200）

龍脷葉是嶺南民間傳統(tǒng)常用止咳平喘中藥，始載于《嶺南采藥錄》，其中所記載的龍脷葉“治痰火咳嗽，以其葉煮豬肉湯食之”[1]。臨床上龍脷葉常用于治療“支氣管炎、支氣管哮喘、肺結核咳嗽”等呼吸道疾病[2-3]，近年來，對龍脷葉的藥理研究報道主要涉及抗炎及止咳作用，對平喘作用的研究較少。本研究采用大鼠哮喘模型，觀察龍脷葉水提取物對哮喘大鼠支氣管及肺組織的病理學及血清中IL?5、TXB2和6?Keto?PGF1α的影響，初步探討龍利葉平喘的作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠40只，雌雄各半，體質量140～160 g，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號:SCXK（粵）2018?0002，飼養(yǎng)于廣東藥科大學實驗動物中心，使用許可證號:SYXK（粵）2017?0125。

1.2 藥物

龍脷葉水提取物制備：龍脷葉（批號180801，符合2015年版《中國藥典》標準，廣東時珍制藥有限公司），剪碎，大小約為2 cm×2 cm，加10倍量水煎煮1 h，煎煮2次，醫(yī)用棉花過濾，合并濾液，濃縮至每毫升相當于生藥量1 g（1 g/mL）。地塞米松注射液（2 mg/mL，批號1704292，江蘇漣水制藥有限公司）;0.9%NaCl注射液（批號H18060814，山東華魯制藥有限公司）;烏拉坦（批號Z30S9Y71673，上海源葉生物科技有限公司）。

1.3 試劑

卵清白蛋白（OVA）（批號1031K051，北京Solar?bio公司）;氫氧化鋁凝膠（批號O1004A，大連美侖生物技術有限公司）;IL?5和TXB2 ELISA試劑盒（批號分別為：L190109529、L181211238，武漢優(yōu)爾生生命科學裝備有限公司）;6?Keto?PGF1αELISA試劑盒（批號：TY3CXHLYC6，武漢伊萊瑞特生物科技有限公司）;無水乙醇、二甲苯、鹽酸、氨水、中性樹膠（國藥集團化學試劑有限公司）;蘇木素?伊紅染液（G1005，武漢谷歌生物科技有限公司）。

1.4 主要儀器

霧化箱（自制，30 cm×19 cm×17 cm）；WH?802超聲波霧化器（廣東粵華醫(yī)療器械廠有限公司）；Neo?fuge 15R臺式高速冷凍離心機（力康生物醫(yī)療科技控股有限公司）；MX?F渦旋混合器（武漢塞維爾生物科技有限公司）；DW?86L626超低溫冰箱（青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司）；RT3100自動洗板機（雷杜生命科學股份有限公司）；Epoch酶標檢測儀（美國伯騰儀器有限公司）；JJ?12J脫水機（武漢俊杰電子有限公司）；JB?P5包埋機（武漢俊杰電子有限公司）；RM2016病理切片機（上海徠卡儀器有限公司）；JB?L5凍臺（武漢俊杰電子有限公司）；KD?P組織攤片機（浙江省金華市科迪儀器設備有限公司）；Nikon Eclipse CI正置光學顯微鏡（Nikon Corporation）；Nikon DS?U3成像系統(tǒng)（Nikon Corporation）。

2 方法

2.1 實驗分組

40只大鼠隨機分為正常組（N組）、模型組（Mo組）、龍脷葉水提取物高劑量組（H組）、龍脷葉水提取物低劑量組（L組）、地塞米松組（De組），每組8只（雌性4只，雄性4只，分組分性別分籠飼養(yǎng)），實驗前適應性喂養(yǎng)1周。

2.2 哮喘模型建立

參考文獻［4?5］制備大鼠哮喘模型：除正常組外，其余各組于實驗第1天腹腔注射含OVA 100 mg與100 mg氫氧化鋁凝膠的生理鹽水混懸液1 mL，致敏大鼠，正常組以生理鹽水代替OVA腹腔注射，第15天開始將大鼠置于自制的透明密閉霧化箱，以2%OVA生理鹽水溶液最大量超聲霧化吸入激發(fā)，每次30 min，連續(xù)激發(fā)14 d，正常組以生理鹽水代替OVA超聲霧化吸入。除正常組外大鼠腹腔注射OVA后即出現(xiàn)精神萎靡、拱背蜷縮等表現(xiàn)。在霧化激發(fā)后前5～10 min出現(xiàn)躁動不安、搔抓鼻子皮毛等癥狀，10 min后活動明顯減少、毛發(fā)豎立、俯臥不動、伸頸等表現(xiàn)為模型建立成功。

2.3 給藥方法

從第15天起于每次激發(fā)前1 h灌胃給藥，N組與Mo組灌服注射用生理鹽水1 mL/100 g；De組灌服地塞米松注射液0.5 mg/kg；根據(jù)《中國藥典》規(guī)定用量9～15 g，按徐叔云教授主編的《藥理實驗方法學》中不同實驗動物與人的等效劑量比值來計算實驗用藥劑量，即H、L組灌服龍脷葉水提取物劑量分別為5.4 g/kg與1.35 g/kg；每天1次，連續(xù)14 d。

2.4 標本采集

2.4.1 血清樣本采集 末次給藥霧化吸入OVA激發(fā)哮喘后24 h內(nèi)，各組大鼠分別給予20%的烏拉坦生理鹽水溶液（劑量0.8 g/kg）腹腔注射麻醉，眼眶內(nèi)靜脈取血3～5 mL，3 500 r/min離心15 min，吸取血清，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4.2 肺組織樣本采集 大鼠取血后迅速剖取肺臟。取左側肺臟組織固定于4%(φ)多聚甲醛24 h以上。

2.5 指標檢測

2.5.1 肺組織病理學觀察 將固定后的組織逐級酒精脫水、包埋、切片，HE染色法，封片后在光學顯微鏡下觀察支氣管與肺組織的病理變化，比較各組大鼠支氣管與肺組織病理學變化。

2.5.2 血清IL?5、TXB2和6?Keto?PGF1α含量檢測 將保存于-80℃血清進行解凍處理，按ELISA試劑盒操作說明進行IL?5、TXB2和6?Keto?PGF1α檢測。

2.5.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 應用SPSS18.0統(tǒng)計軟件分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示。兩組樣本間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 肺組織病理學觀察

肺組織HE染色結果顯示,N組：支氣管上皮細胞結構完整，排列緊密（A），局部可見細支氣管(B)管腔內(nèi)有少量脫落的上皮細胞（黑色箭頭）及少量嗜酸性黏液分泌（黃色箭頭）；組織中可見較多肺泡壁輕度增厚，并伴有少量淋巴細胞與中性粒細胞浸潤(C)（紅色箭頭）。如圖1。

Mo組：多見支氣管管腔內(nèi)有少量脫落的上皮細胞(A)（黑色箭頭）及少量嗜酸性黏液分泌（黃色箭頭），局部支氣管管腔內(nèi)可見較多紅細胞（藍色箭頭）；多見血管周圍有較多炎性細胞浸潤成環(huán)，形成血管套袖（紅色箭頭）；多見支氣管、血管周圍與肺泡組織內(nèi)有較多巨噬細胞浸潤(B)（綠色箭頭），多見肺泡壁增厚，并伴有較多炎性細胞浸潤(C)（紅色箭頭）。如圖2。

De組：支氣管上皮細胞結構完整，排列緊密（A），局部細支氣管管腔內(nèi)有少量嗜酸性黏液分泌（黑色箭頭），局部管腔內(nèi)可見少量脫落的上皮細胞（黃色箭頭）及少量紅細胞（藍色箭頭）；血管周圍“套袖”樣炎性浸潤消失，多見支氣管與血管周圍肺泡腔中有較多巨噬細胞浸潤（紅色箭頭）；多見肺泡壁增厚，伴有較多淋巴細胞與中性粒細胞浸潤（綠色箭頭）。如圖3。

H組：局部可見支氣管管腔內(nèi)有少量脫落的上皮細胞（黑色箭頭）及少量嗜酸性黏液分泌（黃色箭頭），局部支氣管管腔內(nèi)可見少量紅細胞；血管周圍“套袖”樣炎性浸潤明顯減少或消失，局部可見血管或氣管周圍肺泡腔中有較多巨噬細胞浸潤（藍色箭頭）；多見肺泡壁增厚，局部有較多炎性細胞浸潤（紅色箭頭）。如圖4。

L組：局部可見支氣管管腔內(nèi)有少量脫落的上皮細胞（黑色箭頭）及少量嗜酸性黏液分泌（黃色箭頭）；血管周圍“套袖”樣炎性浸潤明顯減少或消失，局部可見血管或氣管周圍肺泡腔中有較多巨噬細胞浸潤（綠色箭頭）；組織中可見大量肺泡壁增厚，并伴有較多淋巴細胞與中性粒細胞浸潤（紅色箭頭）；局部可見肺泡腔內(nèi)有少量嗜酸性物質（藍色箭頭）。如圖5。

圖1 正常對照組肺組織染色結果(200×)Figure 1 Histopathology of lung tissues in the normal group(200×)

觀察圖1～圖5中各實驗組的肺組織染色結果可知，與N組相比，M組支氣管管腔內(nèi)有部分上皮細胞脫落，支氣管、血管周圍和肺泡組織炎性細胞明顯增多，且在血管周圍形成明顯的“套袖”環(huán)，哮喘病變樣改變明顯，表明實驗造模成功。與M組相比，De、H、L組中巨噬細胞等炎性細胞均有明顯減少，血管周圍“套袖”樣炎性浸潤明顯減少或消失，表明治療組能有效改善哮喘大鼠的肺組織和支氣管病變。

圖2 哮喘模型組肺組織染色結果(200×)Figure 2 Histopathology of lung tissues in the model group(200×)

圖3 地塞米松組肺組織染色結果(200×)Figure 3 Histopathology of lung tissues in the dexamethasone group(200×)

圖4 龍脷葉高劑量組肺組織染色結果（200×）Figure 4 Histopathology of lung tissues in the high dose of Sauropus spatulifolius group(200×)

3.2 大鼠血清中IL?5、TXB2和6?Keto?PGF1α濃度水平

與正常組比較，模型組IL?5和TXB2濃度水平顯著升高(P＜0.01)，而6?Keto?PGF1α濃度水平顯著降低(P＜0.01)，TXB2/6?Keto?PGF1α比值顯著升高(P＜0.01);地塞米松組、龍脷葉水提取物高劑量、低劑量組分別與模型組相比，IL?5和TXB2濃度水平顯著降低(P＜0.01)，而6?Keto?PGF1α濃度水平顯著升高(P＜0.01，P＜0.05）；TXB2/6?Keto?PGF1α比值顯著降低(P＜0.01)。見表1。

圖5 龍脷葉低劑量組肺組織染色結果（200×）Figure 5 Histopathology of lung tissues in the low dose of Sauropusspatulifolius group(200×)

表1 各組大鼠血清中炎性因子水平比較Table 1 Comparison of inflammatory factors in serum of rats in each group(x±s,n=8)

4 討論

哮喘是呼吸道常見疾病，通常認為哮喘是由多種細胞特別是肥大細胞、嗜酸性粒細胞、T淋巴細胞參與的慢性氣道炎癥。IL?5是由活化的Th2細胞產(chǎn)生的細胞因子，可刺激嗜酸性粒細胞生長和分化，主要表現(xiàn)為對嗜酸性粒細胞(EOS)募集、遷移入呼吸道并維持炎癥反應具有正向調控作用,嗜酸性粒細胞浸潤和IL?5表達水平增高是哮喘支氣管黏膜的特征性改變[6]。研究表明,IL?5是哮喘炎癥中的主要調節(jié)因子[7?8]。

血栓素A2（TXA2）和前列腺素I2（PGI2）的比例失衡在哮喘發(fā)病中的作用，已越來越受到國內(nèi)外學者的關注[9?10]。TXA2可促使血小板聚集，氣道平滑肌收縮，還可促使氣道分泌物增多，血管滲透性增高，從而加重氣道的炎癥反應，而PGI2的作用幾乎與TXA2的作用相反。因此，TXA2增高或PGI2下調，致TXA2/PGI2比例失衡或增高引起支氣管平滑肌收縮而導致哮喘[11?13]。TXA2和PGI2在體內(nèi)水解為活性很小但更穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物TXB2和6?ket?PGF1α，常 以TXB2和6?ket?PGF1α作 為 觀 察TXA2和PGI2活性的標志物。因此，血清TXB2和6?ket?PGF1α水平可作為衡量TXA2和PGI2平衡的標志物[14?16]。

本實驗結果顯示龍脷葉提取物能降低哮喘大鼠血清中IL?5、TXB2濃度水平和TXB2/6?ket?PGF1α比值，顯著升高6?keto?PGF1α濃度水平，提示龍脷葉水提取物可能通過降低炎性細胞濃度水平從而減輕哮喘模型大鼠肺組織與氣管的炎性病理改變,促進哮喘大鼠肺功能的恢復。但在治療組（地塞米松組、龍脷葉提取物高劑量、低劑量組）的病理切片中氣管與肺泡組織周圍仍可觀察到較多的巨噬細胞與炎性細胞，這種情況有待進一步探討。后續(xù)可進行更深入的血清化學研究，結合高效液相法和質譜分析法檢測鑒定有效成分，將有助于闡明其發(fā)揮哮喘作用的物質基礎。