黃芪注射液對LPS所致THP?1源性巨噬細胞炎癥的干預作用

蔡大可，李鈺婷，胡子旋，甘海寧，黃雪君，黃丹娥，楊九妹，賴亦靜，李方圓，陳玉興

（1.廣東省中醫藥工程技術研究院，廣東廣州510095；2.廣東省中醫藥研究開發重點實驗室，廣東廣州510095；3.廣州中醫藥大學第五臨床醫學院，廣東廣州510405；4.中山大學新華學院，廣東廣州510520）

黃芪作為一味傳統中藥，具有益氣養元、扶正祛邪、養心通脈、健脾利濕等功效[1]。現代醫學研究發現單味黃芪、復方黃芪及其有效成分均具有保護心血管[2?3]、降血糖血脂[4?5]、免疫調節[6?7]、保肝[8]、護腎[9]、抗腫瘤[10]等藥理作用。有文獻表明黃芪具有較強抗炎活性的同時兼具免疫調節的雙重作用[11?12]，避免一般抗炎藥物治療所引起的機體免疫失衡等不良反應，滿足于現代抗感染治療的新需求而被廣泛用于臨床治療心氣虛損、心脈瘀阻之病毒性心肌炎[13]、心功能不全及脾虛濕困之肝炎[14]等病癥。巨噬細胞作為上述炎癥相關疾病的關鍵免疫細胞，能夠左右疾病的轉歸與發展，同時也能夠被治療藥物所調控[15?16]。巨噬細胞根據其活化狀態、發揮功能以及分泌因子的不同，分為M1型和M2型，M1型巨噬細胞通過干擾素?g（interferon?g，INF?g）及細菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）活化，主要分泌促炎因子IL?1β等；M2型巨噬細胞通過分泌IL?4、IL?10等抗炎因子從而發揮抑制炎癥反應以及組織修復等作用[17?18]。兩種分型巨噬細胞的數量比例對炎癥反應的發生及消退起著關鍵的作用，且M1和M2型巨噬細胞的轉化與炎癥小體信號通路NLRP3/CASPASE?1/IL?1β的調控有關[19]，因此后者與黃芪的抗炎分子機制密切關系。黃芪注射液是我國CFDA批準上市的黃芪提取物藥品，具有明確的抗炎作用[20]，但是其對巨噬細胞的炎癥表征以及關鍵促炎因子IL?1β的調控還尚未闡明。本實驗通過在LPS刺激THP?1源性巨噬細胞的模型上，探討黃芪注射液對巨噬細胞炎癥因子表達的影響作用，在細胞水平上為黃芪注射液在臨床抗炎應用以及藥物作用機理研究中提供參考。

1 實驗材料

1.1 主要儀器

BS224S電子天平（1/萬），購自德國Sartorius公司；5450型小型高數離心機，購自德國Eppendorf公司；IM5?50型全自動雪花制冰機，購自常熟市雪科電氣有限公司；VarioskanFlash型全波長多功能酶標儀，購自美國Thermo公司；IQTM5型熒光定量PCR儀和SmartSpecplus核酸蛋白測定儀，購自美國Bio?Rad公司；ini?protean Teral Cell垂直電泳槽、Pow?erPac Basic電泳儀、M制膠器均購自美國Bio?Rad公司；PVDF膜，購自美國MilliPore公司；Tanon 5200 Multi多功能成像系統，購自上海天能科技有限公司。

1.2 主要試劑

黃芪注射液，購自正大青春寶藥業有限公司，批號：1810112；LPS，購自廣州奕元生物技術有限公司，批號：20180616；佛波酯（PMA），購自美國Sigma公司，批號：20190103；RPMI?1640培養基，購自上海中喬新舟生物科技有限公司，批號：201811；1%10 U/mL青霉素和10 mg/mL鏈霉素混合液（雙抗），購自美國Gibco公司，批號：20180907；胎牛血清，購自博維根生物制品有限公司，批號：181023；無水乙醇和異丙醇，購自廣州化學試劑廠，批號：20181102；脫氧核糖核酸去離子水，購自天根生化科技（北京）有限公司，批號：20180722；TRIzol?總RNA提取試劑，購自康為世紀生物科技有限公司，批號：20180117；SYBRgreen和反轉錄試劑盒均購自日本Takara公司，批號：20180114；PCR引物，由英濰捷基上海貿易有限公司合成；NLRP3和caspase?1抗體，購自艾博抗（上海）貿易有限公司，批號：201811；CCK8試劑盒，購自東仁化學（上海）有限公司，批號：20180901；IL?4、IL?10和IL?1βELISA試劑盒，購自上海邦奕生物科技有限公司，批號：201809；RIPA蛋白裂解液，購自北京索萊寶科技有限公司，批號：201810；蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、5×SDS?PAGE購自美國bimake生物科技有限公司，批號：201809。

2 方法

2.1 細胞培養

THP?1細胞株購自上海生物化學與細胞生物學研究所細胞中心。THP?1單核細胞用含10%（φ）胎牛血清、1%10 U/mL青霉素和10 mg/mL鏈霉素混合液的RPIM?1640培養基，置于37℃、5%（φ）CO2培養箱中靜置培養，細胞數目維持在1×106cells/mL，待生長良好，以6×105cells/mL細胞數接種于相應板中。

2.2 細胞分組

將生長良好的THP?1單核細胞均勻接種于96孔板中，每組6個復孔，用于黃芪注射液對細胞增殖的檢測。在接種細胞的同時，給予10 nmol/L PMA誘導24 h，將THP?1單核細胞誘導為巨噬細胞，24 h后將含PMA培養基棄去，換成完全培養基繼續培養48 h，后換無血清培養基100 mL/孔，同時給予相應藥物，分別為正常組、黃芪注射液（HQ）10%[注射劑體積/（培養基體積+注射劑體積）]、5%、2.50%、1.25%、0.625%、0.313%、0.156%、0.078%組，每組6個復孔，重復兩塊板。干預24 h后，其中一塊板每孔加入10 mL CCK8,另一塊不作處理。1 h后用全波長酶標儀在450 nm波長下檢測其吸光度值A，計算細胞存活率（存活率=A給藥組/A空白組×100%）。

將生長良好的THP?1單核細胞均勻接種于6孔板中，每組3個復孔，共6組，分別為正常對照組（Control）、模型組（LPS 500 ng/mL）、LPS+黃芪注射液200μL/mL（HQ200）、LPS+黃芪注射液100μL/mL（HQ100）、LPS+黃芪注射液50μL/mL（HQ50）、LPS+黃芪注射液25μL/mL（HQ25），以同樣的方法誘導單核細胞分化為巨噬細胞后，換無血清培養基2 mL/孔，同時給予相應藥物，重復2次實驗，干預24 h后，上清液用于ELISA檢測，細胞用于PCR和WB的檢測。

2.3 ELISA檢測細胞上清液中IL?4、IL?10和IL?1β的含量

在藥物干預24 h后，收集細胞上清液，根據ELISA試劑盒說明書，用多功能酶標儀在450 nm波長下檢測A值，再根據公式計算IL?4（Y=-3.48×10-7X2+6.65×10-4X+1.31×10-4）、IL?10(Y=7.06×10-10X2+4.07×10-5X?5.16×10-3)和IL?1β(Y=?7×10-7X2+0.001X+0.034)的含量。

2.4 RT?qPCR檢測炎癥相關基因mRNA的表達

每孔細胞中加入1 mL TRIzol，室溫放置5 min，根據TRIzol總RNA提取試劑說明書提取細胞總RNA，用0.5 mg總RNA根據反轉錄試劑盒說明書將RNA轉錄為cDNA，再對其進行擴增，用b?actin基因作為內參對照基因，在反應條件：步驟1：94℃×5 min；步驟2：94℃×30 s→60℃×30 s→72℃×50 s（45個循環）；步驟3：72℃×7 min下，進行RT?qPCR擴增，運用2-△△C t法計算各組基因相對表達量。相關引物信息如表1所示。

表1 炎癥相關引物序列Table 1 Primers sequences of inflammation?related genes

2.5 Western blot檢測炎癥相關蛋白的表達

將RIPA、蛋白酶抑制劑、磷酸化酶抑制劑按照100∶1∶1的體積比制成混合物，六孔板中的細胞每孔加入100 mL RIPA混合物，并在4℃下裂解5～10 min，用細胞刮刀將細胞刮取轉移至1.5 mL EP管中，進行超聲離心后，吸取上清，根據上清量加入5×SDS?PAGE蛋白緩沖液，95℃煮沸5 min使蛋白變性，-80℃下保存。根據目的蛋白條帶選擇分離膠濃度，對照標準Marker條帶大小取所需要的蛋白條帶，轉膜，封閉，孵育一抗，洗滌，孵育二抗，洗滌，在化學發光液中浸泡1 min后，用凝膠自動成像系統對條帶進行拍攝。用ImageJ軟件對條帶進行半定量分析。

2.6 統計學處理

實驗數據用SPSS22.0軟件進行處理，結果用均值±標準差（±s）表示，服從正態分布的數據用單因素方差分析，不服從正態分布的數據用非參數檢驗的Kruskal?Wallis檢 驗，P＜0.05為 差 異 有 統 計 學意義。

3 結果

3.1 黃芪注射液對巨噬細胞增殖的影響

如圖1所示，10 mL/mL以內系列濃度的黃芪注射液對細胞無毒性，且可促進細胞增殖，因而在安全范圍內選取系列濃度進行藥效研究。

3.2 黃芪注射液對LPS所致巨噬細胞炎癥因子分泌的影響

如表2所示，在LPS刺激下，巨噬細胞分泌抗炎因子IL?4、IL?10含量顯著降低（P＜0.05），而趨化因子IL?1β的分泌量顯著升高（P＜0.05）；在給予黃芪注射液干預后，與LPS組相比，IL?4和IL?10的分泌量呈上升趨勢，其中HQ100組和HQ50組的IL?4分泌量顯著升高（P＜0.01），HQ100組和HQ25組的IL?10分泌量顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.01），而各組IL?1β分泌量均顯著降低（P＜0.05,P＜0.01）。

圖1 黃芪注射液對巨噬細胞增殖的影響Figure 1 Effect of astragalus injection on macrophage prolif?eration（±s，n=6）

3.3 黃芪注射液對巨噬細胞炎癥相關基因mRNA表達的影響

如圖2所示，在LPS刺激下，巨噬細胞中抗炎因子IL?4、IL?10 mRNA表達量明顯降低（P＜0.05），而促炎因子IL?1β、CASPASE?1、IL?6以及IL?18 mRNA的表達量顯著升高（P＜0.01）；在給予黃芪注射液干預后，與LPS組相比，IL?4和IL?10mRNA表達量均呈上升趨勢（P＜0.01），I L?1β、C A S PA S E?1、IL?6以及IL?18 mRNA表達量顯著降低（P＜0.01）。

3.4 黃芪注射液對巨噬細胞炎癥相關蛋白表達量的影響

如圖3所示,在LPS的刺激下，巨噬細胞炎癥小體NLRP3及其下游cleaved?CASPASE?1蛋白表達量顯著升高（P＜0.01）；在黃芪注射液的干預下，與LPS組比較，HQ25、HQ50和HQ200組的NLRP3、cleaved?CASPASE?1蛋白表達量顯著降低（P＜0.01）。

表2 黃芪注射液對巨噬細胞炎癥因子分泌的影響Table 2 Effect of astragalus injection on the secretion of IL?4,IL?1βand IL?10 in macrophages（±s，n=3） ρ/(pg·mL?1)

表2 黃芪注射液對巨噬細胞炎癥因子分泌的影響Table 2 Effect of astragalus injection on the secretion of IL?4,IL?1βand IL?10 in macrophages（±s，n=3） ρ/(pg·mL?1)

與正常組比較：#P＜0.05；與LPS組比較：*P＜0.05，**P＜0.01。

組別Control LPS HQ200 HQ100 HQ50 HQ25藥物濃度-500 ng/mL 200μL/mL 100μL/mL 50μL/mL 25μL/mL IL?4 212.06±2.90 193.92±3.26#213.36±27.69 216.90±1.95**220.15±2.98**196.78±6.63 IL?10 1 612.84±174.61 1 360.03±35.19#1 465.35±93.53 1 620.90±48.41**1 504.34±71.31 1 860.14±115.40**IL?1β 106.46±6.46 125.60±9.10#111.36±5.34*105.84±1.17*99.82±6.76**103.99±13.53**

圖2 黃芪注射液對炎癥基因mRNA表達的影響Figure 2 Effect of astragalus injection on the mRNA expression of inflammatory genes（±s，n=3）

圖3 黃芪注射液對炎癥相關蛋白表達量的影響Figure 3 Effect of astragalus injection on the expression of inflammation?related protein（±s，n=3）

4 討論

黃芪注射液是中藥黃芪按照標準中藥成方制劑所提取的注射劑，其成分之一芒柄花素可與AMPK間接結合激活自噬，降低LPS誘導的NLRP3表達[21]。在小鼠巨噬細胞（ANA?1細胞）中黃芪注射液可上調自噬通量，抑制炎癥因子IL?1β、IL?6的分泌從而發揮抗炎作用[22]。本實驗驗證黃芪注射液具有明顯的抗炎作用，而且發現其抗炎作用與NLRP3/caspase?1的激活相關。同時，其抗炎作用亦與抗炎因子與促炎因子的轉錄水平、翻譯水平、兩類因子的相互轉化有相關性。

THP?1細胞因具有與人原代單核細胞相似的形態和功能，且具有穩定的基因背景，而常被用于免疫和炎癥的研究。本實驗通過用佛波酯（PMA）將THP?1細胞誘導分化為巨噬細胞，進而通過LPS誘導巨噬細胞M1型極化用以造成巨噬細胞炎癥反應。實驗發現，將巨噬細胞用LPS處理后，趨化因子IL?1β的分泌明顯增加，且炎癥因子IL?1β、CAS?PASE?1、IL?6、IL?18 mRNA表達以及NLRP3及其下游激活型CASPASE?1蛋白表達量也顯著升高。IL?1β是M1型巨噬細胞標志性炎性因子[23]，也是介導各種炎癥反應的關鍵因子，在LPS或某些病毒的刺激下可誘導單核細胞、巨噬細胞等分泌[24]，對單核/巨噬細胞具有特異性趨化，從而激活炎性反應的下游環節，促進IL?6、IL?18等的分泌，最終形成炎癥性損傷[25]。由此可見，LPS可刺激巨噬細胞轉化為促炎M1型巨噬細胞，致使IL?1β相關炎癥小體炎癥的激活，該結果驗證LPS調控巨噬細胞分化及促炎的作用[26]。黃芪注射液作為抗炎藥物，能否逆轉LPS所致的炎癥小體激活仍有待驗證。

在給予黃芪注射液干預后發現，THP?1源性巨噬細胞中IL?1β的轉錄水平、胞外分泌下降，IL?1β的翻譯后修飾調控蛋白NLRP3及caspase?1亦受到抑制，且炎癥因子I L?6、IL?18 mRNA表達也明顯減少。鑒于IL?1β為巨噬細胞參與多種疾病發生發展的關鍵因子，其激活過程需要經過轉錄翻譯表達和剪切激活等關鍵步驟[27]，黃芪注射液對于IL?1β轉錄及其上游NLRP3炎癥小體活性均有調控作用，提示黃芪注射液的調控靶點可能為IL?1β及NLRP3共同上游的調控因子——活性氧[28]。另外，本實驗研究發現黃芪注射液可明顯上調IL?4和IL?10的mRNA表達以及分泌。IL?4和IL?10是M2型巨噬細胞抑制性細胞因子，M2型巨噬細胞可通過這些抑制性細胞因子下調免疫應答，限制炎性反應[21]。換言之，黃芪注射液可促進巨噬細胞從M1型向M2型轉化。由于巨噬細胞極化亦為細胞內活性氧所調控，黃芪注射液促巨噬細胞極化的作用可能與其調控活性氧本身或其相關分子靶點相關。

綜上所述，黃芪注射液具有明顯的抗炎藥效，并通過逆轉巨噬細胞NLRP3/caspase?1/IL?1β炎癥小體激活以及誘導巨噬細胞M2極化等雙重調控來實現，從而抑制炎癥反應發生。本實驗從細胞水平上對黃芪注射液的抗炎作用進行研究，為黃芪注射液的臨床應用及藥理作用研究提供了分子生物學基礎。