朱砂安神丸對條件性恐懼模型大鼠單胺類神經遞質表達及其神經元c?Fos蛋白表達的影響

郭文成，劉斌，張麗娟，王艷艷，黃莉莉，李廷利

（黑龍江中醫藥大學藥學院，黑龍江哈爾濱150040）

恐懼是人類的基本情感。正常范圍內的恐懼情緒可以激發個體一系列的防御機制。當恐懼情緒無法正常消退時，比如可能導致神經系統、內分泌系統等多個系統的失調和紊亂，以致個體的機能出現障礙，誘發焦慮癥、抑郁癥等疾病[1]。

杏仁核基底外側核（BLA）是恐懼信息采集和輸入的重要區域。當外界恐懼刺激發生后，恐懼信息首先由BLA輸入加工，再傳遞給杏仁中央核（Ce）激活各個腦區，形成恐懼情緒并表達出恐懼特征。BLA區域內的單胺類神經遞質含量的變化，與恐懼情緒的調節有關[2]。

朱砂安神丸是鎮痛安神的代表方劑，出自金元時期著名醫家李東垣所著的《內外傷辨惑論》，由朱砂、黃連、地黃、當歸、甘草組成。王瑩[3]、楊越[4]、陳建寧[5]等對朱砂安神丸促進恐懼記憶消退和潛在機制進行了研究,亦有朱砂安神丸抗驚厥、解熱、鎮痛和抗心律失常等作用的臨床或實驗研究[6]。

本實驗利用微透析聯合高效液相電化學以及c?Fos蛋白免疫組化，檢測在朱砂安神丸干預下條件性恐懼記憶的習得和消退階段，BLA區域內單胺類神經遞質含量變化和c?Fos蛋白表達情況的影響，探討朱砂安神丸對條件性恐懼大鼠拮抗作用及其作用機制。

1 材料與試劑

1.1 動物

SD大鼠，雄性，體質量（240±10）g，SPF級，由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供，生產許可證號：SCXK（黑）2018?007。實驗時間為每天早8:00～11:00，實驗動物飼養在獨立、避光、通風的實驗室。實驗室實行12 h明暗交替光照，溫度（24±2）℃，相對濕度保持在50%～60%，聲音在40分貝以下。

1.2 試劑

朱砂安神丸（蜜丸，每丸9 g，吉林省鑫輝藥業有限公司，產品批號：20170701）；5?羥色胺鹽酸鹽標準品（純度：99.8%，批號：111656?200401）、酒石酸去甲腎上腺素標準品（質量分數：94.3%，批號：KFZA?8UP）、鹽酸多巴胺標準品（質量分數：99.8%，批號；F29H?EQSB）均購于中國食品藥品檢定研究院；一抗試劑（兔抗c?Fos，北京博森生物）；兔二步法試劑盒（北京中杉金橋生物科技）；羊血清工作液（北京中杉金橋生物科技）；DAB顯色試劑盒（無錫傲銳東源生物科技）；進口羊血清工作液（無錫傲銳東源生物科技）。

1.3 主要儀器

XR?XC404?2條件性恐懼實驗監測系統（上海欣軟）；SuperFcs條件性恐懼實驗分析系統（上海欣軟）；S1130高效液相泵（德國Sykam）；AntecSDC電化學檢測器（荷蘭安泰克）；Clarity高效液相工作站(捷克DataApex)；DM400顯微鏡（德國萊卡）。

2 方法

2.1 朱砂安神丸混懸液的制備

朱砂安神丸成年人的最大服用劑量為9 g。按照體表面積折算法計算，可知大鼠的給藥劑量0.81 g/kg。配制方法：取朱砂安神丸9 g，并加入適量雙蒸水，充分研磨，定容于100 mL容量瓶中，得到朱砂安神丸混懸液。

靜心想來，的確如此。那些人或多或少都會有強硬的人際關系當本錢，而他阿東的本錢就只這張文憑，這是他奮斗數年掙來的。盡管有了它，找起工作來依然不如人家，但對于阿東，到底聊勝于無啊。

2.2 套管和探針植入

大鼠在飼養環境適應7 d，并于植入手術前24 h開始禁食。腹腔注射10%(φ)水合氯醛麻醉大鼠，充分暴露和清潔顱骨表面，使前囟點清晰可見。參考George Paxinos&Charles Watson大鼠腦立體定位圖譜，確定BLA的三維坐標為Ap=+2.8 mm，RL=+4.7 mm，DV=-7.5 mm，使用腦立體定位儀進行定位。用顱骨鉆刺穿此位置顱骨，將探針套管植入大鼠腦右側BLA區域，用玻璃離子水門汀固定。術后將大鼠單籠飼養并恢復3 d。

2.3 動物分組及給藥

術后恢復3 d，將埋置探針的大鼠60只，隨機分為恐懼習得空白組、恐懼習得模型組、恐懼習得給藥組、恐懼消退空白組、恐懼消退模型組、恐懼消退給藥組，每組10只。早7:00各給藥組給予朱砂安神丸混懸液（0.09 g/mL，9 mL/kg），各空白組和模型組給予相同體積的雙蒸水，每日1次，連續7 d。末次給藥后進行條件性恐懼模型的復制、消退實驗以及微透析取樣實驗。

2.4 條件性恐懼動物模型的復制及消退實驗[7-8]

將大鼠置于刺激箱中2 min后給予模型組和給藥組5 s的聲音信號（2 000 Hz、75 dB），再同時給予5 s聲音信號和電刺激（0.75 mA），以上結束后1 min內無處理，重復20次，停留2 min取出；各空白組只給予聲音信號。

條件性恐懼記憶的習得測試：模型復制次日，將各組大鼠置于刺激箱2 min。各組給予10 s聲音信號（2 000 Hz、75 dB），結束后1 min內無處理，同時記錄大鼠僵直反應時間。此過程重復5次。

條件性恐懼記憶的消退測試：習得測試后的第1、3、5、7 d，將大鼠置于刺激箱2 min。各組給予10 s聲音信號（2 000 Hz、75 dB），結束后1 min內無處理，同時記錄大鼠僵直反應時間。以上重復5次。

2.5 微透析樣品收集

取下大鼠頭頂的假探針，植入CMA探針，將透析管路系統依序連接。微量進樣泵速度為0.8μL/min；保持整個管路暢通；低溫微量收集器溫度設置為4℃。將大鼠置入自由活動裝置中，準備收集腦透析液。前1個小時平衡整個系統，舍棄收集液。此后開始收集腦透析液，時間為2 h。將收集好的透析液迅速轉移到-80℃冰箱中，等待檢測。

2.6 HPLC?ECD測定大鼠腦透析液中單胺類神經遞質的含量[6,9]

2.6.1 色譜條件 色譜柱Sykam C18（3μm，2.1 m×100 m），流動相中：Na2HPO4·H2O：13.8 g/L；辛烷磺酸鈉：160 mg/L；EDTA·H2O：10 mg/L；甲醇：100 mL/L；KCl：149.2 mg/L。使用H3PO4溶液調節pH至2.95～3.05范圍內；以0.2μm濾膜抽濾4次；超聲1 h；存放于-4℃冰箱中待使用。流動相流速0.2 mL/min。工作電極電壓：0.52 V。柱溫：40℃。工作電極：玻璃碳電極。參比電極：銀電極。進樣量：20μL。分析時間：25 min。

2.6.2 標準曲線與線性范圍 精密稱取NE、DA、5?HT的標準品各1 mg，取0.1 mol/L的高氯酸1 mL，將3種標準品溶于高氯酸中配置成濃度為1 mg/mL的標準品溶液，混合均勻。按梯度稀釋濃度為50 pg/mL、25 pg/mL、12.5 pg/mL、6.25 pg/mL和3.125 pg/mL的標準品溶液，放入-80℃冰箱中等待檢測。以各目標物的色譜峰面積（Y）對其濃度（X，pg/mL）進行線性回歸分析，得到標準曲線及相關系數。

2.6.4 微透析探針的體外回收率 實驗進行前于一級水中浸泡探針1 h以活化探針。精密稱取5?HT、DA、NE各1 mg。以林格氏溶液作為溶劑配置成1 ng/mL的混合標準品。將探針放入混合標準品中，連接微量進樣泵，以林格氏溶液作為灌流液0.8μL/min進行灌注，收集2個小時樣品，放入-80℃冰箱中。得到的樣品進樣3次測出濃度取平均值，通過公式R體外=C樣品/C標品計算出平均回收率，測得探針的體外回收率，以此折算腦內的真實含量水平。見表1。

表1 體外回收率實驗結果Table 1 Experimental results of in v it ro recovery rate

2.7 心臟灌流、取腦以及腦組織切片

將大鼠麻醉，四肢固定，在劍突下打開腹腔，剪開隔膜，暴露出心臟，于左心室插入注射針，同時剪開右心耳，用250 mL生理鹽水、250 mL 4%(φ)多聚甲醛溶液置于點滴瓶中，依序進行灌流。待大鼠肢體僵硬后收集腦組織，在4℃冰箱中放置一晚。第2日取出腦組織，依次置于5%蔗糖溶液4 h，10%蔗糖溶液4 h，20%蔗糖溶液中過夜，以進行組織脫水。次日，用OCT包埋劑浸泡4 h后，使用液氮速凍，放入-80℃冰箱中等待切片。切片厚度5 nm，每間隔3張切片取1張待用。

2.8 朱砂安神丸對條件性恐懼記憶消退過程大鼠的BLA神經元c?Fos蛋白表達的影響[10]

2.8.1 c?Fos免疫組織化學染色 室溫下，切片用0.01 mol/L的PBS沖洗5 min，重復3次；以Triton?X100溶液于37℃水中孵育30 min；0.01 mol/L的PBS沖洗5 min，重復3次；H2O2孵育5 min；0.01 mol/L的PBS沖洗5 min，重復3次；封閉處理10%正常羊血清；1∶400稀釋兔抗c?Fos抗體在4℃下孵育48 h；滴加生物素山羊抗兔IgG，在37℃水浴孵育60 min；0.01 mol/L的PBS沖洗5 min，重復3次；DAB處理3～5 min；mager’s蘇木精溶液染色5 s，用75%、85%、90%、95%、100%（Ⅰ）、100%（Ⅱ）濃度的酒精及二甲苯（Ⅰ）和二甲苯（Ⅱ）按梯度脫水，每個濃度的酒精浸泡5 min二甲苯溶液浸泡10 min。取出后用中性樹脂進行封片，在60℃的烘箱中放置5 d。

2.8.2 c?Fos蛋白的統計方法 使用光學顯微鏡觀察采集切片照片c?Fos蛋白免疫組化顯色反應，根據腦立體定位圖譜準確定位到BLA區域，陽性神經元蛋白質表達的顏色和陰性神經元蛋白質顏色表達不同。神經元細胞核陽性染色后表現出棕黃色，陰性染色后表現出藍紫色。使用Imagepro?Plus6.0專業圖像軟件統計每只大鼠腦組織切片BLA區內c?Fos陽性神經元的累積光密度（integrated optical density，IOD）。以BLA區域內0.01 mm 2個單位內的c?Fos陽性神經元的IOD值來表示c?Fos蛋白表達的強弱，IOD值越高說明此區域內的神經元越為活躍，反之就是神經元表達不活躍，以此來判斷BLA腦區內神經元的活動狀態。

2.9 統計方法

實驗數據用x±s表示，采用SPSS 21.0進行統計分析，3組之間實驗數據采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 方法專屬性考察

3.1.1 標準曲線與線性范圍 各目標物的檢出限較低，在3.125～50 pg/mL范圍內線性關系良好。結果見表2。

表2 3種單胺遞質的線性回歸方程Table 2 Linear regression equations of three monoamine transmittersq

3.1.2 精密度及加標回收率 結果見表3。

3.2 朱砂安神丸對大鼠條件性恐懼記憶的影響

見圖1和圖2。處于條件性恐懼模型習得期的大鼠：與空白對照組相比，模型組的僵直反應時間均顯著延長，兩組比較差異有統計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，給藥組的僵直反應時間略低于模型組，但差異無統計學意義（P＞0.05）。

表3 日內日間精密度及加樣回收率實驗結果（n=5）Table 3 Experimental results of intra?day precision and sample recovery rate(n=5)

處于條件性恐懼模型消退期的大鼠：與空白對照組相比，模型組的僵直反應時間顯著延長，兩者相比較差異有統計學意義（P＜0.01）。與模型組相比，給藥組的僵直反應時間均低于模型組。其中在第5天給藥組的僵直時間顯著低于模型組，兩者相比較差異有統計學意義（P＜0.05）。在第7天給藥組的僵直時間顯著低于模型組時間，兩者比較差異有統計學意義（P＜0.01）。

圖1 條件性恐懼大鼠恐懼記憶習得過程的僵直反應時間Figure1 Freezing reaction time of fear memory acquisitionprocess in conditioned fear rats

圖2 條件性恐懼大鼠恐懼記憶消退過程的僵直反應時間Figure2 Freezing reaction time of fear memory regression inconditioned fear rats

圖3 朱砂安神丸對條件性恐懼記憶習得過程大鼠BLA內NE、DA、5?HT含量的影響Figure3 Effects of ZhushaAnshen pill on the contents of NE,DA and 5?HT in BLA of rats with conditioned fear memo?ry acquisition

圖4 朱砂安神丸對條件性恐懼記憶消退過程大鼠BLA內NE、DA、5?HT含量的影響Figure4 Effects of ZhushaAnshen pill on the contents of NE,DA and 5?HT in BLA of rats with conditioned fear memo?ry regression

3.3 朱砂安神丸對條件性恐懼模型大鼠BLA腦區內NE、DA及5?HT含量的影響

見圖3和圖4。處于條件性恐懼模型習得期的大鼠：與空白組相比，模型組BLA內的NE、DA含量均顯著高于空白對照組，兩者比較差異有統計學意義（P＜0.01），5?HT含量顯著低于空白對照組，兩者比較差異有統計學意義（P＜0.01）。，給藥組BLA內的NE、DA含量與模型組相比差異均無統計學意義（P＞0.05）。

處于條件性恐懼模型消退期的大鼠：與空白組相比，模型組的BLA內的c?Fos蛋白表達數量，顯著高于空白組，兩者比較差異有統計學意義（P＜0.01）。與模型組相比，給藥組BLA內的c?Fos蛋白表達數量，顯著低于模型組，兩者比較差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。

3.4 朱砂安神丸對條件性恐懼記憶消退過程大鼠的BLA神經元c?Fos蛋白表達的影響

處于條件性恐懼模型習得期的大鼠：與空白對照組相比，模型組的BLA內的c?Fos蛋白表達數量，顯著高于空白對照組，兩者比較差異有統計學意義（P＜0.01）。，給藥組的BLA內的c?Fos蛋白表達數量與模型組相比，差異無統計學意義（P＞0.05），見表4～表5和圖5～圖6。

處于條件性恐懼模型消退期的大鼠：與空白對照組相比，模型組的BLA內的c?Fos蛋白表達數量，顯著高于空白對照組，兩者比較差異有統計學意義（P＜0.01）。與模型組相比，給藥組的BLA內的c?Fos蛋白表達數量，顯著低于模型組，兩者比較差異有統計學意義（P＜0.01）。

表4 朱砂安神丸對條件性恐懼記憶習得過程大鼠BLA神經元c?Fos蛋白表達的影響Table 4 Effects of ZhushaAnshen pill on the expression of c?Fos protein in BLA of rats with conditioned fear memory acquisition(x±s,n=10)

表5 朱砂安神丸對條件性恐懼記憶消退大鼠BLA神經元c?Fos蛋白表達的影響Table 5 Effects of ZhushaAnshen pill on the expression of c?Fos protein in BLA neurons of rats with conditioned fear memory regression(x±s，n=10)

圖5 條件性恐懼記憶消退大鼠BLA神經元c?Fos蛋白表達情況（200×，標尺100μm）Figure 5 Expression of c?Fos protein in BLA neurons of rats with conditioned fear memory regression(200×,bar 100μm)

圖6 條件性恐懼記憶消退大鼠BLA神經元c?Fos蛋白表達情況（200×，標尺100μm）Figure 6 Expression of c?Fos protein in BLAneurons of rats with conditioned fear memory regression(200×,bar 100μm)

4 討論

杏仁核參與恐懼記憶的形成和表達。杏仁核基底外側核（BLA）主要參與恐懼信息采集和輸入，在調節恐懼情緒中起到非常重要的作用[11]。所以本實驗選取BLA作為藥物作用機制的研究核心，以巴普洛夫條件性恐懼反射為范式，探討朱砂安神丸在條件性恐懼記憶的作用和潛在機制。

從恐懼記憶的神經生物學理論中可推測當條件性恐懼發生時，恐懼信息首先由BLA輸入加工，再由BLA傳遞給Ce，由Ce激活各個腦區例如腦干、藍斑核、皮層、下丘腦等，使個體表現為血壓升高，心律加速，出汗等生理反應，同時引起藍斑、黑質、中縫核等單胺類神經遞質系統釋放失常[1,12?13]。c?Fos基因在受到外界刺激后表達水平發生變化，其產物c?Fos蛋白可用作為神經元興奮的標志[14-15]。利用c?Fos蛋白免疫組織化學技術，檢測條件性恐懼大鼠BLA內神經元c?Fos蛋白的表達水平，藉此判斷該腦區神經元興奮程度。在個體受到應激或驚嚇反應發生時，藍斑核(LC)中的中樞去甲腎上腺能神經元釋放NE，會編碼增強恐懼性記憶，加強個體警覺性，準備應對刺激的反應。NE可以激活環路中的氨基酸，促進對恐懼記憶的恢復。有實驗表明，當腦內多巴胺1（D1）和多巴胺2（D2）被拮抗劑拮抗時，能夠阻礙恐懼記憶的形成和表達，并減弱條件性恐懼行為學上的表現。而當D1和D2受體被激動時，則能促進恐懼記憶的形成和建立[16]。有研究表明5?HT再攝取抑制劑（SSRI）類藥物，可緩解條件性恐懼患者出現的暴躁、焦慮等癥狀[17]。

結合各實驗結果可知，朱砂安神丸拮抗條件性恐懼作用主要發揮在恐懼記憶消退階段。恐懼記憶消退給藥組僵直時間減少，可能原因是朱砂安神丸可以調節BLA腦區神經元的功能，抑制恐懼信息向下游腦區投射；抑制LC內中樞去甲腎上腺能神經元釋放NE，拮抗恐懼記憶的恢復，抑制個體警覺性；使DA含量明顯下降，阻礙恐懼記憶的表達；調節5?HT系統，緩解焦慮等行為的出現。

綜上，朱砂安神丸能夠促進恐懼記憶消退，其機制可能是與調節BLA區域單胺類神經遞質含量、影響神經元功能有關。