槐果堿對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的增殖、凋亡以及TGF?β蛋白的影響

王婷，李海艦，曾伍姣，李莉娟

（廣東省第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東廣州510317）

近年來(lái)，隨著世界經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，全球工業(yè)化規(guī)模超前，而環(huán)境污染卻急劇加重，與之息息相關(guān)的肺癌發(fā)病率和死亡率均呈逐年上升趨勢(shì)。目前，其已成為嚴(yán)重影響公眾健康的世界性問(wèn)題。肺癌作為臨床上最常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)疾病，其發(fā)病率和死亡率居于全球之首，素有腫瘤界最強(qiáng)殺手之稱[1?2]。按組織病理學(xué)分類，肺癌分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌兩類。其中非小細(xì)胞肺癌最為常見(jiàn)，其占肺癌類別的80%以上[3]。中國(guó)人口基數(shù)龐大，而肺癌患者基數(shù)也龐大。據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示[4]肺癌的發(fā)病率和死亡率已位居癌癥首位。而手術(shù)切除、放化療、免疫治療以及分子靶向治療等是目前治療非小細(xì)胞肺癌的主要手段[5]，但其臨床治療效果不甚理想，流行病學(xué)研究顯示肺癌患者5年生存率僅為16%[6]。此外，其耐藥、高復(fù)發(fā)率以及高轉(zhuǎn)移等問(wèn)題也逐漸出現(xiàn)，因此尋找高效、低毒的抗肺癌新藥仍是目前極為急迫的工作之一。

槐果堿(Sophocarpine,SC)是一種具有多種藥理活性的生物堿，其抗腫瘤、抗凋亡以及保護(hù)心肌等多種藥理活性已被發(fā)現(xiàn)[7?9]。近年來(lái)，已有研究報(bào)道[10]槐果堿對(duì)結(jié)腸癌、肝癌、食管癌、白血病等癌性疾病均具有明顯的抑制作用。TGF?β信號(hào)通路與細(xì)胞的正常增殖、分化、表型轉(zhuǎn)化等生物過(guò)程密切相關(guān)，而研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞發(fā)生異常后，如癌細(xì)胞、TGF?β信號(hào)通路的表達(dá)存在異常[11]。Zhang等[12]研究發(fā)現(xiàn)槐果堿可下調(diào)肝癌細(xì)胞TGF?β1蛋白的表達(dá)。目前，槐果堿對(duì)非小細(xì)胞肺癌的作用尚未見(jiàn)相關(guān)的研究報(bào)道，本研究擬通過(guò)研究槐果堿對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的增殖、凋亡和TGF?β蛋白的影響，初步闡明其抗癌作用的機(jī)制，為槐果堿開發(fā)為一種抗非小細(xì)胞肺癌新藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥物與試劑

槐果堿購(gòu)買于西安林禾生物技術(shù)有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%；非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞系購(gòu)買于中科院上海細(xì)胞庫(kù)；RPMI?1640細(xì)胞培養(yǎng)液、PBS緩沖液、胎牛血清、DMSO、青霉素、鏈霉素、0.25%胰酶消化液、CCK?8購(gòu)買于友康生物科技股份有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)買于南京建成生物有限公司；TGF?β1抗體、HRP標(biāo)記二抗購(gòu)于英國(guó)Abcam公司；Annexin V?FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)買于上海美季生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要儀器

LCI?3?165 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（上海龍躍股份有限公司）；T960 PCR儀（力康生物醫(yī)療科技控股有限公司）；RDY?ZY2 Western blot電泳設(shè)備[中科瑞泰(北京)生物科技有限公司]；M200 PRO酶標(biāo)儀(奧地利Tecan公司)；CyFlow?miniPOC流式細(xì)胞儀(德國(guó)Sysmex Pretec公司)。

2 方法

2.1 非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞培養(yǎng)

將非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞系于液氮罐中取出，37℃水浴融化，倒入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加入5 mL RP?MI?1640培養(yǎng)基，其中含有10%(φ)胎牛血清和100 U/mL的青霉素/鏈霉素雙抗，隨后移置于5%(φ)CO237℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。隔天更換新鮮培養(yǎng)液，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿80%以上時(shí)，按照1∶3比例傳代。

2.2 非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖抑制率檢測(cè)

將非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞稀釋為1×105個(gè)，每孔加入100μL，即接種濃度為1×104個(gè)/孔，并培養(yǎng)24 h后，用不同濃度槐果堿處理（終濃度分別為20 μmol/L、40μmol/L、80μmol/L和160μmol/L），其中以0μmol/L為空白對(duì)照組，每組重復(fù)6孔。繼續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72 h，小心加入含10%CCK8溶劑100μL，孵育3 h，最后于波長(zhǎng)為450 nm處檢測(cè)細(xì)胞吸光度A值，增殖抑制率=［1-A(λ)藥物處理組/A(λ)空白對(duì)照組］×100%

2.3 非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞凋亡率檢測(cè)

將梯度濃度槐果堿處理48 h后非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞，分別加入PI和Annexin V/FITC各5μL，輕輕混勻并4℃避光孵育30 min，加入200μL Binding Buffer，流式細(xì)胞儀測(cè)定非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞凋亡情況。

2.4 非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞Bax和Bcl?2表達(dá)水平檢測(cè)

將梯度濃度槐果堿處理48 h后的非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞，按Bax和Bcl?2試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，逐步提取細(xì)胞總RNA（Trizol法），合成cDNA，最終使用PCR儀設(shè)備檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞中Bax和Bcl?2基因的表達(dá)水平。Bcl?2引物序列:F?5′?GACTGAGTACCTGAACCGGCATC?3′，R?5′?CT?GAGCAGCGTCTTCAGAGACA?3′；Bax引 物 序 列:R?5′?CAAACATGTCAGCTGCCACAC?3′，F(xiàn)?5′?CGA ATTGGCGATGAACTGGA?3′;G A P D H引 物 序 列:R?5′?ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA?3′，F(xiàn)?5′?GCA?CAGTCAAGGCTGAGAATG?3′。

2.5 非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞TGF?β1蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

收集藥物作用48 h后的非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞，加入RIPA裂解液20μL，檢測(cè)總蛋白濃度。隨后每孔加入50μg的蛋白量，進(jìn)行SDS?PAGE電泳分離，使用硝酸纖維素膜進(jìn)行轉(zhuǎn)模，5%脫脂奶粉封閉，隨后加入一抗（1∶2 000）于4℃冰箱孵育24 h。PBS緩沖液洗膜5次，加入用HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育3 h，PBS緩沖液洗膜5次，最后ECL試劑進(jìn)行化學(xué)發(fā)光和顯影。使用Image J軟件對(duì)電泳圖像進(jìn)行灰度值分析，并以GAPDH作為參照。而TGF?β1蛋白的相對(duì)表達(dá)水平=TGF?β1條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

2.6 槐果堿與TGF?β1分子對(duì)接

登錄Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）并下載槐果堿的3D化學(xué)結(jié)構(gòu)。登錄Pro?teinDatabase（https://www.rcsb.org/）數(shù) 據(jù) 庫(kù) 并 下 載TGF?β1 3D蛋白晶體結(jié)構(gòu)，并利用Auto Docking軟件對(duì)蛋白晶體結(jié)構(gòu)行進(jìn)行蛋白修飾（加氫、加電子）和分子對(duì)接，最后使用Pymol對(duì)配體最優(yōu)構(gòu)象圖像進(jìn)行繪圖分析。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用表示，多組之間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 槐果堿對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖抑制率的影響

由圖1可見(jiàn)，與空白對(duì)照組比較，槐果堿給藥組的增殖抑制率顯著升高（P＜0.05），隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，各給藥組的增殖抑制率顯著升高（P＜0.05）。

3.2 槐果堿對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞凋亡的影響

從圖2可見(jiàn)，槐果堿給藥組比空白對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率顯著升高(P＜0.01)，其中，空白對(duì)照組的凋亡抑制率為(0.68±0.03)%，而槐果堿給藥組（20、40、80、160μmol/L）的細(xì)胞凋亡率分別為(9.55±0.73)%、(9.89±1.14)%、(14.16±2.42)%和(19.34±3.57)%，呈劑量依賴性。

3.3 槐果堿對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞Bcl?2和Bax mRNA表達(dá)的影響

從圖3可見(jiàn)，槐果堿給藥組比空白對(duì)照組BaxmRNA表達(dá)水平明顯升高(P＜0.05)，而Bcl?2mRNA的表達(dá)水平則明顯降低(P＜0.05)，呈劑量依賴性。

3.4 槐果堿對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的TGF?β1蛋白表達(dá)量的影響

圖1 槐果堿對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖抑制率的影響Figure 1 Effect of sophocarpine on the proliferation inhibition rate of A549 cells（±s，n=6）

圖2 槐果堿對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞凋亡的影響Figure 2 Effect of sophocarpine on the apoptosis of A549 cells（±s，n=6）

從圖4可見(jiàn)，槐果堿給藥組比空白對(duì)照組的TGF?β1蛋白表達(dá)量明顯降低(P＜0.05)，呈劑量依賴性。

3.5 槐果堿與TGF?β1分子對(duì)接

從圖5可見(jiàn)，槐果堿與TGF?β1蛋白（PDB ID:年5vqp）的Vina結(jié)合能為?4.9 kcal/mol，它們之間主要通過(guò)范德華力、烷基、氫鍵和Pi?烷基等作用力相互影響，綜上提示槐果堿與TGF?β1具有較好的結(jié)合活性。

圖3 槐果堿對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞Bcl?2 mRNA和Bax mRNA表達(dá)的影響Figure 3 Effect of sophocarpine on the expression of Bcl?2 and BaxmRNA in A549 cells（±s，n=6）

圖4 槐果堿對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞TGF?β1表達(dá)的影響Figure 4 Effect of sophocarpine on the expression of TGF?β1 in A549 cells（±s，n=6）

圖5 槐果堿與TGF?β1對(duì)接結(jié)果Figure 5 Result of sophocarpine docked to TGF?β1

4 討論

肺癌已成為全球新發(fā)癌癥中發(fā)病率最高的疾病，且發(fā)病逐漸呈現(xiàn)年輕化。雖然臨床上治療方法也在逐漸推進(jìn)，但現(xiàn)有治療方法也逐漸呈現(xiàn)出較多問(wèn)題，如耐藥、副作用多以及預(yù)后效果差等問(wèn)題。其發(fā)病機(jī)制目前尚不十分明確，多種外部因素，如紫外線、環(huán)境污染等可能參與了誘發(fā)基因突變，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)失控，引發(fā)腫瘤的發(fā)生。近年來(lái)，隨著我國(guó)中藥研究的逐漸深入，從中藥庫(kù)中提取抗腫瘤活性成分具有一定的可行性，此外，其具有多靶點(diǎn)治療的優(yōu)勢(shì)，逐步引起科研工作者的重視。因此，深入探討非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生機(jī)制和尋找安全有效的治療新藥，特別是從中藥中尋找抗腫瘤活性成分，顯得非常必要。

腫瘤細(xì)胞有2個(gè)基本生物學(xué)特征，一為增殖異常，二為分化異常。故抑制異常增殖水平是評(píng)價(jià)抗瘤藥物有效性的指標(biāo)之一[13]。本研究發(fā)現(xiàn)槐果堿可顯著抑制非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的增殖抑制，在一定濃度范圍內(nèi)（20～160μmol/L），隨著槐果堿給藥濃度的升高以及處理時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著升高（P＜0.05）。王慶華等[14]研究發(fā)現(xiàn)槐果堿通過(guò)調(diào)控Bcl?2、Bax和p?Akt水平抑制肝癌細(xì)胞SMMC?7721生長(zhǎng),并調(diào)控MMP家族和TIMP家族蛋白抑制肝癌細(xì)胞侵襲能力。曹東旭等[15]研究發(fā)現(xiàn)槐果堿對(duì)人紅白血病K562細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，且這種抑制作用呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性。

在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中，細(xì)胞不僅發(fā)生了異常增殖和分化，更為重要的是細(xì)胞凋亡能力也隨著降低或喪失。研究表明[16]在細(xì)胞凋亡調(diào)控過(guò)程中，Bcl?2家族作用極為重要。其中抑制凋亡基因和促進(jìn)凋亡蛋白分別是Bcl?2家族的2大類基因，以Bcl?2為代表性的抑制凋亡基因和以Bax為代表性的促凋亡基因最為重要[17]。通過(guò)二者的正負(fù)調(diào)控，調(diào)節(jié)細(xì)胞正常凋亡生物過(guò)程，如兩者調(diào)控失衡，則可能引起癌癥的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)槐果堿可明顯升高Bax mRNA的表達(dá)水平(P＜0.05)和降低Bcl?2 mRNA的表達(dá)水平(P＜0.05)，呈劑量依賴性，提示了槐果堿可能通過(guò)影響細(xì)胞凋亡途徑，促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的凋亡進(jìn)程。

TGF?β信號(hào)通路與正常細(xì)胞的增殖、分化、表型轉(zhuǎn)化及腫瘤發(fā)生密切相關(guān)[18]。TGF?β通過(guò)與I型、Ⅱ型受體結(jié)合，傳導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)，激活多種蛋白亞型，如Smad2和Smad3，活化后的Smad2、Smad3最終與Smad4形成復(fù)合物，調(diào)節(jié)特定的基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程，最終影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能[19?20]。TGF?β1是TGF超家族中最經(jīng)典的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子[21]。越來(lái)越多的研究證實(shí)[22?23]，通過(guò)抑制TGF?β信號(hào)通路的傳導(dǎo)可能是治療非小細(xì)胞肺癌的有效手段之一。本研究發(fā)現(xiàn)槐果堿可顯著降低非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的TGF?β1蛋白表達(dá)水平，呈濃度依賴性。此外，分子對(duì)接結(jié)果顯示槐果堿與TGF?β1有較好的結(jié)合活性，提示了槐果堿可能通過(guò)抑制TGF?β1的活性，從而促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的快速凋亡。

綜上所述，槐果堿可劑量依賴性地抑制非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)其凋亡，其抗肺癌活性可能通過(guò)影響肺癌細(xì)胞的增殖、凋亡和TGF?β1的表達(dá)有關(guān)。