別旁茶總苷抗潰瘍性結腸炎的網絡藥理學與分子對接研究

王曉玉，張飛宇，劉莉，何新月，王鳳云

（1.廣東藥科大學健康學院，廣東廣州510310；2.廣東省光與健康工程技術研究中心，廣東廣州510310；3.廣東藥科大學中藥學院，廣東廣州510006）

潰瘍性結腸炎（UC）是一種慢性易發的非特異性炎性腸道疾病[1?2]，其發病率近5年來急劇上升，醫療費用高，且會增加結直腸癌死亡的風險，已成為一種全球性疾病[3?5]。水楊酸抑制劑、糖皮質激素及免疫抑制劑等為UC治療的常規藥物，在一定程度上可緩解及改善UC的癥狀，但服藥周期長、療效欠佳，藥物不良反應嚴重，且停藥后易復發，在臨床應用上有一定局限[6-7]。而傳統民族藥在治療慢性病上發揮重要作用，且相對西藥副作用小[8?11]，比較適合新藥研究開發。

別旁茶（瑤藥名），也稱扭肚藤、斷骨草、豬肚勒花等，為木犀科素馨屬植物扭肚藤Jas minum elon gatum(Bergius)Wiid.的干燥嫩莖及葉，是民族醫藥瑤醫瑤藥中常用的藥物[12]。其性微苦、涼，功效清熱解毒、利濕消滯，用于治療急性胃腸炎、消化不良、痢疾等。動物實驗證實其復方制劑復方扭肚藤膠囊對實驗性腹瀉的治療有良好效果[13]。別旁茶更是作為中成藥腹可安的主藥，在臨床中廣泛應用于腹痛、腹瀉、嘔吐等消化系統疾病的治療，并且對腸易激綜合征患者有較好的治療作用[14]。因為其含有東莨菪素成分可鎮靜消炎[15]，提取物還可以顯著改善結腸組織學損傷，抑制炎癥[16]。前期研究使用超高效液相色譜?飛行時間串聯質譜法（UPLC/Q?TOF?MS法）鑒定別旁茶29種化合物中26種均為苷類[17]。本研究使用網絡藥理學與分子對接的方法系統研究BPC治療UC的活性成分及其作用靶點，為民族藥別旁茶的深度開發提供數據基礎和科學依據。

1 資料與方法

1.1 別旁茶苷活性成分的獲取與收集

運用Pubchem數據庫（pubchemblog.ncbi.nlm.nih.gov）篩選11種環烯醚萜苷類化合物[17]并結合使用Swiss target prediction數據庫(http://www.swisstar?getprediction.ch/)進行靶點預測，以P＞0.05進行相關靶點篩選。將最終獲得化合物的蛋白靶點，通過Uniprot數據庫（https://www.uniprot.org/）中的ID map?ping進行官方名稱校正。

1.2 疾病靶點與有效化合物靶點的篩選與收集

通過Genecard數據庫（https://www.genecards.org/）、DisGeNET數據庫(http://disgenet.org/)搜集UC相關疾病靶點，將疾病靶點與化合物靶點取其兩者共同交集，導入Cytoscape 3.6.0軟件構建“成分—靶點—疾病”網絡。

1.3 疾病與藥物的差異基因分析

將獲得的共同靶點通過STRING數據庫（https://string?db.org/）構建PPI網絡模型，之后導入Cyto?scape 3.6.0，利用Cytoscape插件CytoHubba尋找排名前10的差異表達基因。

1.4 Go分析與KEGG通路富集分析

運用DAVID6.8數據庫（https://david.ncifcrf.gov/）將“1.3”項下獲得的關鍵共同靶點進行GO功能與KEGG通路富集分析。其中以參數P＜0.05，設定為HOMO species篩選出count值前10個來分析生物過程（biological process,BP）、分子功能（molecular?function,MF）、細胞組成（cellular component,CC）的GO富集功能和KEGG信號通路。最后用易漢博生物在線網站做氣泡圖進行分析數據。

1.5 核心有效成分與靶點的對接

使用AutoDock分子軟件將差異表達排名前4位的靶點與6種別旁茶苷核心活性成分進行分子對接分析，結合能越低說明結合程度越緊密。

2 細胞體外試驗驗證

2.1 材料與細胞株

別旁茶苷（Jasminoside，HPLC≥96%，成都Alfa Biotechnology Company Limited）;Caco?2細胞(中科院上海細胞庫)；1640基礎培養基(Life Science公司，批號：AC11225278)；FBS（Gibico公司，批號：42F2362K）；雙抗（Gibico公司，批號：1881459）；胰酶（TRYPSIN）(VWR amreso Life Science，批 號：0106C059)；MTT(Sigma公司，批號：MKCB8895)；Rabbit anti?NF?κBp65(Cell signaling technology公司，批號：9);β?actin Mouse mAb(博 士 德 公 司，批 號：BM0627)；TransAMNF?κBp65試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司，批號：220680351）。

2.2 方法

2.2.1 Caco?2細胞培養 應用10%（體積分數，下同）胎牛血清的1640培養液，將Caco?2細胞在37℃、5%CO2培養箱條件下進行培養，3～4 d可基本融合。取對數期細胞用于實驗，實驗時對細胞進行常規消化、計數。

2.2.2 炎癥細胞模型的篩選

2.2.2.1 IL?1β誘導模型的篩選 將Caco?2細胞培養24 h，分為正常對照組、模型組，加入10 ng/mL IL?1β分別刺激0.5、1、3、12 h后，收集細胞。采用Trans AMNF?κBp65試劑盒檢測各時間點的細胞核蛋白NF?kBp65的含量，確定IL?1β最佳刺激時間點。

2.2.2.2統計分析 采用GraphPad prism 8.0分析軟件進行統計分析，使用單因素方差分析(One?WayANOVA)檢驗比較各組間顯著性差異，P＜0.05被認為具有統計學意義。

2.2.3 四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法（MTT法）檢測別旁茶總苷對Caco?2細胞活性的影響 取細胞密度達到80%～90%的Caco?2細胞，按5×105個/mL接種于96孔板中，每孔180μL，隨后置于恒溫培養箱中，待4 h后，細胞貼壁，對細胞進行分組：Control組，別旁茶苷濃度梯度組（6.25、12.5、25、50、100、200 mol/L）每組設置6個復孔，Control組每孔加入20μL基礎培養基，別旁茶苷梯度組每孔加入20μL相應濃度10倍的別旁茶苷溶液。孵育20 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT儲備液10μL，繼續孵育4 h，孵育結束后，取注射器小心吸棄上清，再加入150μL二甲基亞砜，于震板儀上充分溶解甲臜結晶10 min后，在波長分別為490、630 nm處檢測其吸光值，并計算。

2.2.4 Western blot檢測別旁茶苷對Caco?2細胞NF?κB p65蛋白表達的影響 取對數生長期的Caco?2細胞，按1×106個/mL接種于6孔板中，每孔2 mL，鋪板均勻后，置于恒溫培養箱。貼壁過夜，對細胞分為3組：Normal組、模型組、別旁茶苷梯度組。棄去培養基，PBS清洗1次后，Normal組、模型組加入完全培養基，別旁茶苷梯度組進行別旁茶苷處理24 h。24 h后，加入IL?1β刺激0.5 h，棄去培養基，1 mL PBS清洗2次，用細胞刮刮取細胞至離心管中，在1 260 r/min、4℃條件下，離心5 min，棄去上清液，按蛋白提取試劑盒說明書提取細胞核蛋白并檢測蛋白濃度，按4∶1加入5×Loading Buffer，在95℃以上水浴加熱5 min，得Western Blot實驗樣品。Western Blot具體實驗步驟參照文獻[30]進行。

3 結果

3.1 化學成分篩選與靶點預測

運用Pubchem數據庫并結合Swiss target predic?tion數據庫篩選出8種活性化合物，基本信息見表1。分別預測所有單體活性成分，共得到靶點139個，導入Cytoscape 3.2.1軟件，將別旁茶苷8種有效成分和139個有效靶點建立可視網絡拓撲圖，見圖1。

表1 別旁茶苷有效活性化合物的基本信息Table 1 Basic information of the effective active compounds in BPC

3.2 別旁茶苷抗潰瘍性結腸炎的關鍵靶點分析

通過GeneCard、DisGeNET與TTD數據庫搜集靶點，去重后獲得UC靶點，運用score中位數篩選出靶點，易漢博生物信息網站在線做Venn圖，取疾病靶點與化合物靶點二者的共同交集，詳細信息見圖2。獲得共同關鍵靶點有139個，將獲得共同靶點通過STRING數據庫構建PPI網絡模型，之后將數據導入Cytoscape 3.6.0進行可視化分析。運用Cytoscape插件CytoHubba找到差異表達基因，顏色越深越重要，如圖3所示。其中排名前4的分別是CASP3、EGFR、SRC、MMP9。

3.3 藥物?靶點?疾病共同靶點的網絡構建

將TNF?α、NMUR2、ADRA2A、ACHE、AKR1B1、CA7、CA12、CA4、CA2、NOX4、RPS6KA3等靶點導入Cytoscape 3.6.0軟件構建“化學成分-共同靶點-潰瘍性結腸炎”PPI網絡圖，見圖4，可判斷出三者的相互作用關系。

圖1 別旁茶苷活性成分靶點圖Figure 1 Target map of the effective active compounds in BPC

圖2 別旁茶苷與潰瘍性結腸炎的韋恩圖Figure 2 Venn diagram of BPC and ulcerative colitis

圖3 別旁茶苷治療潰瘍性結腸炎排名前10靶點Figure 3 Top 10 targets for BPC treatment of ulcerative colitis

圖4 化學成分-共同靶點-潰瘍性結腸炎的PPI網絡圖Figure 4 PPI network diagram of Chemical composition?common target?ulcerative colitis

3.4 別旁茶苷抗潰瘍性結腸炎的核心通路篩選

將“1.3”項下獲得的關鍵共同靶點導入DAVID 6.8數據庫進行GO功能與KEGG通路富集分析。獲得生物過程（biological process，BP）217個，主要涉及信號傳導、負調節凋亡過程、氧化還原過程等。分子功能（molecularfunction,MF）獲得78個，主要涉及蛋白結合、鋅離子結合、蛋白激酶活性等。細胞組成(cellular component，CC)獲得37個，質膜、胞質、細胞質、膜的整體組成部分、細胞外來體、核漿、細胞外空間、原生質膜的組成成分、細胞外區域等。通過易漢博生物在線作圖，以count值前10與P值≤0.05進行篩選，篩選結果見圖5。KEGG信號通路有119個，主要與NF?kappa B信號通路、癌癥通路、蛋白多糖、PI3K?Akt信號通路、神經活性配體?受體相互作用、鞘脂信號通路、Rap1信號通路等有關。以count值前10與P≤0.05為標準，篩選結果見圖6。

3.5 核心活性與靶點的分子對接驗證

找到重要6種活性化合物（山柰酚?3?O?蕓香糖苷、橄欖苦苷、jasminoside、苜蓿素、jashemsloside A、jashemsloside B），將BPC治療UC差異表達排名前4的基因（CASP3、EGFR、SRC、MMP9）進行分子對接，其中靶點基因與蛋白間活性的結合能等信息見圖7。結合能越低，說明活性成分與靶點受體結合越緊密，顯示苜蓿素與前4靶點結合方式較為相似，且結合能優于陽性藥物美沙拉嗪，均落于靶點受體的活性中心內，見圖8。

圖5 別旁茶的活性成分靶點的GO富集分析圖Figure 5 GO enrichment analysis diagram of active ingredient target in BPC

圖6 別旁茶抗UC作用靶點的KEGG富集分析圖Figure 6 KEGG enrichment analysis diagram of BPC anti?UC target

圖7 關鍵靶點與別旁茶苷成分的結合能熱圖Figure 7 Heat map of the binding energy of key targets and BPC components

圖8 關鍵靶點與苜蓿素的分子對接（與陽性藥比較）Figure 8 Molecular docking between key targets and alfalfa(compared with positive drugs)

3.6 細胞體外實驗驗證

3.6.1 別旁茶苷實驗濃度的確定

別旁茶苷實驗濃度確定結果見圖9。與正常對照組比較，濃度為12.5、25、50μmol/L的別旁茶苷對細胞活性沒有影響(P＞0.05)，而別旁茶苷濃度為100、200μmol/L時對細胞活性抑制明顯(P＜0.05)，故將12.5、25、50μmol/L確定為別旁茶苷的實驗濃度，用于后續實驗。

圖9 別旁茶苷實驗濃度的考察Figure 9 Experimental concentration of BPC

3.6.2 IL?1β誘導的Caco?2細胞NF?κBp65蛋白的相對含量

IL?1β刺激細胞各時間點NF?κBp65蛋白含量均高于正常對照組，其中刺激0.5 h細胞NF?κBp65蛋白含量最高，故確定IL?1β最佳刺激時間點為0.5 h，見圖10。

圖10 IL?1β誘導的Caco?2細胞細胞NF?κBp65蛋白相對含量Figure 10 The relative content of NF?κBp65 protein in Caco?2 cells induced by IL?1β

3.6.3 別旁茶苷對IL?1β誘導的NF?κB信號通路活化的影響

該部分對IL?1β激活的經典炎癥信號通路NF?κB通路進行檢測。由“3.6.2”項下數據確定使用IL?1β刺激細胞0.5 h作為炎癥模型，別旁茶苷對IL?1β誘導的NF?κB信號通路活化的影響結果見圖11。與正常組比較，模型組IL?1β能明顯誘導NF?κB信號通路活化，增加通路核蛋白NF?κBp65的表達，且具有統計學意義。而與模型組比較，別旁茶苷可以明顯緩解細胞核NF?κBp65的表達，且具有劑量依賴性。

圖11 別旁茶苷對NF?κBp65蛋白表達的影響Figure 11 The effect of BPC on the expression of NF?κBp65 protein

4 討論

UC發病具有癥狀多樣性、非特異性、發病較為隱匿、病因不明確等特點，給臨床治療帶來很大的難度，如何做到個體化治療或未病先防，是目前有待解決的醫療難題。中醫可根據UC患者體質的差異進行辨證施治，同時還能做到未病先防，在治療UC方面具有獨特的優勢[18?19]。瑤藥別旁茶的藥理研究主要集中在腸胃炎、濕熱痢疾、腸胃消化等幾個方面，臨床上可作為中成藥腹可安的主藥，其許多化合物都具有抗感染作用[20?21]。前期研究使用UPLC/Q?TOF?MS法鑒定出別旁茶含有29種化合物[17]，通過Swiss target predictiony分析（P≥0.05）篩選出山柰酚?3?O?蕓香糖苷、橄欖苦苷、jaspogeranoside A、素馨苦苷?O?β?D?葡萄糖苷、jasminoside、苜蓿素、jashemsloside A、jashemsloside B為主要核心活性化合物。

PPI網絡分析結果顯示TNF、PTGS1、MAPK14、CXCR1、LGALS3、IL?2等靶點與UC有關，其中TNF、PTGS1是促炎性細胞因子，CXCR1是IL?8的受體，IL?2是抑炎細胞因子[22?23]。提示別旁茶苷中化合物可能通過調節炎性細胞靶點進行抗UC。大量、難以控制的出血成為UC癥狀，而別旁茶苷可作用于KDR、CA2、MMP2等多個靶點以調節血管[24]。

氧化脂質衍生物能激活NF?κB[6]，誘導單核細胞結合到內皮細胞，導致炎癥形成。而別旁茶苷可能通過激活PXR、CYP3A抑制NF?κB的表達，從而促進消化系統功能，調節脾胃，止血止瀉，降低炎癥因子TNF?α、IL?6、IL?1β和TGF?β1的水平，發揮保護作用[25?28]。本研究篩選出NF kappa B signaling pathway、Pathways in cancer、Proteoglycans in cancer等119條通路，其中NF?κB信號通路排名前列，通過體外細胞實驗篩選結果得知，別旁茶總苷確能降低IL?1β誘導的炎癥細胞核蛋白NF?κBp65的含量，且呈現一定的劑量依賴性，與本文網絡藥理學預測的假設具有一致性。

分子對接結果分析顯示，CASP3、EGFR、SRC、MMP9是別旁茶苷的差異靶點蛋白，它們與6種核心活性化合物的結合較為緊密，其中苜蓿素結合能優于陽性藥美沙拉秦，這進一步提示別旁茶總苷通過NF?κB發揮UC治療作用的可行性。此外，別旁茶苷類成分在臨床應用還需更多體內實驗驗證。

本研究應用網絡藥理學和分子對接方法探討了別旁茶苷抗UC作用主要靶點和信號通路，結果表明別旁茶苷類成分苜蓿素具有潛在研究價值。另體外細胞實驗顯示，別旁茶總苷確能降低NF?κBp65的表達，這為民族藥的實驗研究及產品開發提供了科學依據。