MiR?873?5p靶向HNRNPK調控糖尿病腎病足細胞的增殖和凋亡

熊軒，劉昌淳，黎建文，邱越，周彩燕，鄭韜，嚴躍紅，梁劍波

（1.廣州醫科大學附屬順德醫院腎臟內科，廣東佛山528315；2.廣州醫科大學附屬順德醫院內分泌科，廣東佛山528315；3.廣州醫科大學附屬第五醫院腎臟內科，廣東廣州510799；4.廣州醫科大學附屬第二醫院腎臟內科，廣東廣州510260）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）一直是慢性腎病和腎功能衰竭的主要原因[1]。在過去的20年里，DN的發病率和死亡率在世界范圍內迅速上升[2]。足細胞及足突之間裂孔隔膜是腎小球過濾的最后一道屏障，足細胞的增殖和凋亡對維持腎小球濾過屏障的完整性至關重要，對臨床DN治療具有重要意義[3]。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長度為20～25個核苷酸的內源性非編碼RNA，通過特異性翻譯抑制或者誘導mRNA降解，調控細胞的生長、分化、增殖和凋亡等，以及參與機體多種生理和病理過程[4?5]。近年來研究發現許多miRNAs在DN患者中異常表達并參與足細胞增殖、凋亡、損傷等DN的病理過程[6?7]。已有研究報道mi R?873?5p在胃癌[8]、肺癌[9]、結直腸癌[10]等癌細胞的增殖和凋亡過程中發揮重要的調控作用，但關于它在DN中的作用機制仍未完全明確。核內不均一核糖核蛋白K（HNRNPK）定位于人第9染色體，是一種高度保守、廣譜表達的DNA/RNA結合蛋白，在腫瘤的增殖、凋亡、轉移等生物學過程中發揮重要的調控作用[11]。但HNRNPK在DN中的調控機制尚未十分清楚。本研究通過分析miR?873?5p和HNRNPK在高糖誘導的足細胞中表達，探討miR?873?5p是否通過靶向HNRNPK以影響高糖誘導的足細胞的增殖和凋亡。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

MPC5小鼠足細胞購于上海中國科學院細胞庫；RPMI?1640培養基、胎牛血清購于美國Gibco公司；葡萄糖購于美國Sigma公司；PCR引物、mi RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒以及熒光定量試劑盒購于日本Takara公司；miR?873?5p模擬物（mi R?873?5 mimic）、miR?873?5p抑制物（miR?873?5p inhibitor）和對照物（NC inhibitor）序列以及靶向HNRNPK的siR?NA序列（si?HNRNPK）和對照序列（si?NC）均購于上海吉碼公司；Lipofectamine 2000轉染試劑盒購于美國Invitrogen公司；CCK8細胞增殖檢測試劑盒、RI?PA裂解液、SDS?PAGE膠配制試劑盒均購于上海碧云天公司；Annexin?VFITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購于南京凱基公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購于美國Promega公司；iMark型酶標儀購于美國BIO?RAD公司；ABI 7500實時熒光定量聚合酶鏈反應儀購于美國Applied Biosystems公司；流式細胞儀購于美國BD公司。

1.2 細胞培養

MPC5細胞采用添加有10%(φ)胎牛血清的RP?MI?1640培養基培養，以1×105個/mL細胞濃度將細胞接種至12孔板中，隨后置于37℃、5%(φ)CO2培養箱中進行培養。收集指數生長期的細胞用于后續實驗。為了模擬糖尿病高糖損傷，在上述培養基中再添入終濃度為30 mol/L的葡萄糖建立高糖損傷細胞模型。高糖誘導培養24 h后qRT?PCR檢測正常培 養（Cells）和 高 糖 培 養（H?Cells）細 胞 中miR?873?5p相對表達水平。

1.3 細胞轉染與分組

將細胞分為正常組（Cells）、高糖組（H?Cells）、高糖轉染對照組（H?NC inhibitor）、高糖miR?873?5p抑 制 劑 組（H?mi R?873?5p inhibitor）、H?miR?873?5p inhibitor+si?NC組、H?miR?873?5p inhibitor+si?HNRN?PK組。細胞轉染按照Lipofectamine 2000轉染試劑盒說明書操作步驟進行，經葡萄糖誘導后的MPC5細胞，轉染24 h后qRT?PCR檢測轉染效果。

1.4 qRT?PCR檢 測miR?873?5p和HNRNPK相 對表達

收集細胞，采用用Trizol試劑提取細胞總RNA，隨后按逆轉錄試劑盒說明書進行操作。將總RNA逆轉錄合成cDNA，并以此cDNA為模板，按照熒光PCR試劑盒說明書配置反應體系并在ABI 7500實時熒光定量PCR儀中分別檢測miR?873?5p和HNRNPK表達水平。miR?873?5p相對表達水平以U6作為內參，HNRNPK相對表達水平以GAPDH作為內參。運用2-ΔΔCt方法計算miR?873?5p和HNRN?PK的相對表達水平。

1.5 細胞增殖檢測

采用CCK8細胞增殖檢測試劑盒對各組細胞的增殖進行檢測。將各組細胞接種至96孔板中，每組設置3個重復，置于37℃、5%CO2條件下培養0 h、24 h、48 h、72 h，各組細胞經各時間點培養后，每孔加入10μL CCK8試劑，輕輕混勻，黑暗條件下37℃培養箱中孵育2 h。在450 nm波長下分別檢測各組細胞的吸光度（A)值，繪制細胞增殖曲線。

1.6 流式檢測細胞凋亡

將各組細胞進行接種，培養箱中孵育48 h后，按照Annexin?VFITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒對各組細胞進行處理，流式細胞儀分析各組細胞中凋亡細胞所占比例。

1.7 雙熒光素酶報告基因實驗

熒光素酶報告載體（psiCHECK2?HNRNPK?WT、psiCHECK2?HNRNPK?MUT）分別與miR?873?5 mim?ics、miR?873?5p inhibitor共轉染小鼠足細胞。轉染8 h后，更換新鮮培養液繼續培養。轉染48 h后，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書步驟操作，以海參熒光素酶的發光強度與螢火蟲熒光素酶發光強度的比值反映miR?873?5p與HNRNPK的結合力。

1.8 Western blot實驗

收集各組細胞，加入預冷的RIPA裂解液裂解細胞，提取細胞總蛋白。各組取定量（20μg）變性的蛋白樣品進行SDS?PAGE電泳，然后將蛋白經電轉至PVDF膜上，室溫條件下3%的胎牛血清封閉膜1 h。分別加入一抗：anti?HNRNPK抗體（1∶1 000）和anti?GAPDH抗體（1∶2 000），4℃條件孵育過夜，經TBST洗膜3次；室溫條件下經辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶3 000）孵育2 h，再TBST洗膜3次，采用增強的化學發光系統（ECL）顯色測定各組蛋白條帶的光密度，以GAPDH條帶作為蛋白相對表達內參。

1.9 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件對所有實驗數據進行統計分析，數據資料以（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩組之間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 高糖誘導足細胞中miR?873?5p表達

QRT?PCR結果表明，與對照組（1.00±0.05）相比，高糖組細胞中miR?873?5p相對表達水平（7.39±0.29）顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 干擾miR?873?5p表達促進高糖培養的足細胞增殖

qRT?PCR結果顯示，在高糖培養的足細胞中，轉染miR?873?5p inhibitor組細胞中miR?873?5p相對表達水平顯著低于轉染NC inhibitor的對照組（P＜0.05），見圖1A。細胞增殖實驗結果顯示，在培養24 h、48 h和72 h這3個時間點時，高糖組細胞的增殖能力均顯著低于正常培養的細胞組（P＜0.05）。而培養24 h、48 h和72 h這3個時間點時，轉染miR?873?5p inhibi?tor的高糖培養的細胞組的增殖能力均顯著高于轉染NC inhibitor的高糖培養的細胞組（P＜0.05），見圖1B。

2.3 干擾miR?873?5p表達抑制高糖誘導的足細胞凋亡

細胞凋亡實驗結果顯示，高糖組細胞的凋亡比例顯著大于正常培養的細胞組（P＜0.05）；而轉染miR?873?5p inhibitor的高糖培養的細胞的凋亡比例顯著低于轉染NC inhibitor的高糖培養的細胞組（P＜0.05）,見圖2。

2.4 miR?873?5p對HNRNPK表達的靶向調控作用

運用miRcode數據庫對miR?873?5p的靶基因進行預測，發現miR?873?5p與HNRNPK 3’UTR存在結合位點，HNRNPK可能是miR?873?5p的靶基因,見圖3A。雙熒光素酶報告實驗結果顯示：與Blank組相比，mi R?873?5p mimics與WT?HNRNPK細胞中熒光活性顯著降低（P＜0.05），而miR?873?5p inhibitor與WT?HNRNPK細胞中熒光活性顯著上調（P＜0.05）；與Blank組相比,miR?873?5p mimics與MUT?HNRNPK細胞和miR?873?5p inhibitor與WT?HNRNPK細胞中熒光活性無明顯差異（P＞0.05）。見圖3B。qRT?PCR結果表明，與對照組相比，高糖組細胞中HNRNPK相對表達水平顯著下調（P＜0.05）；而轉染miR?873?5p inhibitor的高糖培養的細胞中的HNRNPK相對表達水平顯著高于轉染NC inhibitor的高糖培養的細胞（P＜0.05）。見圖3C。

2.5 在高糖誘導的足細胞中干擾miR?873?5p的同時敲低HNRNPK的表達

設計3條靶向敲低HNRNPK表達的siRNA序列（si?RNA1、si?RNA2、si?RNA3），分別轉染足細胞，以轉染si?NC序列作為對照。qRT?PCR和Western blot結果均顯示，與轉染si?NC序列相比，轉染靶向敲低HNRNPK表達的si RNA序列（si?RNA1、si?RNA2和si?RNA3）均能敲低HNRNPK mRNA和蛋白的表達（P＜0.05），但是si?RNA1效果最顯著，所以在后續高糖培養的足細胞中選擇轉染si?RNA1（si?HNRNPK）靶向敲低HNRNPK表達。見圖4A和圖4B。隨后在高糖誘導的足細胞中干擾mi R?873?5p的同時敲低HNRNPK的表達，qRT?PCR和Western blot結果均顯示，與轉染miR?873?5p inhibitor+si?NC組相比，轉染miR?873?5p inhibitor+si?HNRNPK細胞中HNRNPK mRNA和蛋白表達水平均下調（P＜0.05）。見圖4C和圖4D。

圖1 CCK8實驗檢測干擾miR?873?5p表達對高糖培養的足細胞增殖的影響Figure 1 Effect of miR?873?5p interference on podocyte proliferation in high glucose culture by CCK8 assay

圖2 細胞流式實驗檢測干擾miR?873?5p表達對高糖培養的足細胞凋亡的影響Figure 2 Effect of mi R?873?5p interference on podocyte apoptosis in high glucose culture by flow cytometry assay

2.6 干擾miR?873?5p表達同時干擾HNRNPK的表達對高糖誘導的足細胞增殖的影響

細胞增殖實驗結果顯示，在培養48 h和72 h這2個時間點時，轉染miR?873?5p inhibitor+si?HNRN?PK的高糖培養的細胞的增殖能力均顯著低于轉染miR?873?5p inhibitor+si?NC的高糖培養的細胞組（P＜0.05）。見圖5。

圖3 miR?873?5p對HNRNPK表達的靶向調控作用Figure 3 Effect of miR?873?5p on the expression of HNRNPK

圖4 在高糖培養的足細胞中干擾mi R?873?5p的同時干擾HNRNPK的表達Figure 4 Interference of miR?873?5p and HNRNPK expression in podocytes cultured with high glucose

圖5 干擾miR?873?5p表達同時干擾HNRNPK的表達對高糖培養的足細胞增殖的影響Figure 5 Effect of miR?873?5p and HNRNPK interference on podocyte proliferation in high glucose culture

2.7 干擾miR?873?5p表達同時干擾HNRNPK的表達對高糖誘導的足細胞凋亡的影響

細胞凋亡實驗結果顯示，轉染miR?873?5p inhi?bitor+si?HNRNPK的高糖培養的細胞的凋亡比例顯著高于轉染miR?873?5p inhibitor+si?NC的高糖培養的細胞組（P＜0.05）。見圖6。

圖6 干擾miR?873?5p表達同時干擾HNRNPK的表達對高糖培養的足細胞凋亡的影響Figure 6 Effect of mi R?873?5p and HNRNPK interference on podocyte apoptosis in high glucose culture

3 討論

雖然近些年關于DN發病機制的研究取得了一定的進展，但其高發率和不良預后并沒有得到很大改善，尋找新的治療DN靶點具有重要意義[12]。足細胞肥大、足細胞脫離和足細胞凋亡可能導致DN患者尿蛋白的增加[13]。因此，足細胞增殖和凋亡在DN發病中占有重要地位。近年來越來越多的研究表明異常表達的miRNAs在糖尿病及其并發癥等疾病的病理生理學中發揮重要作用[14]。比如，在高糖處理的足細胞中，miR?770?5p的表達水平上調，干擾miR?770?5p表達通過靶向TRIAP 1抑制高糖誘導的足細胞凋亡[15]。MiR?15b?5p通過抑制細胞凋亡、氧化應激和靶向SEMA3A的炎癥反應，改善高糖誘導的足細胞損傷[16]。miR?873?5p作為miRNAs家族的一員，已被證明在人類腫瘤中發揮重要作用。Wang等[10]研究發現miR?873?5p通過NF?κB通路直接靶向JMJD8抑制細胞增殖和上皮間充質轉化。Wang等[17]報道miR?873?5p通過抑制IGF2BP 1的表達，抑制膠質母細胞瘤的發生和轉移。然而，關于miR?873?5p在DN中的功能尚不清楚。本研究發現，與正常細胞相比，miR?873?5p在高糖處理足細胞中表達上調，提示miR?873?5p可能參與調控足細胞的增殖和凋亡；隨后研究發現干擾miR?873?5p的表達可促進高糖處理的足細胞的增殖，提示干擾miR?873?5p表達對高糖處理的足細胞增殖有一定的促進作用。表明以長期高血糖為表型的糖尿病引起的腎病可能通過誘導miR?873?5p高表達抑制足細胞的增殖有關。腎足細胞凋亡是慢性腎病、小兒腎病綜合征及局灶節段性腎小球硬化等多種腎臟疾病的重要發病機制[18]。本研究發現干擾miR?873?5p的表達能夠抑制高糖處理的足細胞的凋亡，表明糖尿病引起的腎病還可能通過誘導miR?873?5p高表達促進足細胞發生凋亡有關。

為了探討miR?873?5p在DN進展中的作用機制，本研究通過在線工具預測miR?873?5P與HNRNPK有理論結合位點。結果表明，異常表達的HNRNPK與腫瘤的發生、發展和預后有關[19]。HNRNPK表達下調能夠明顯減少轉移性肺腫瘤結節的形成[20]。此外，HNRNPK在細胞內穩態中也起著重要作用。HNRNPK作為p53的輔助激活因子，對DNA損傷修復起調節作用，下調HNRNPK可降低p53的轉錄，導致DNA損傷所致的細胞周期阻滯[21]。Su等[22]發現HNRNPK在糖尿病腎病大鼠中低表達，而Hordenine治療能夠促進HNRNPK的表達。隨后的熒光素酶分析表明，HNRNPK是miR?873?5P的靶點。同Su等結果一致，本研究發現HNRNPK在高糖培養的足細胞中低表達，而干擾miR?873?5p表達時高糖培養的足細胞中HNRNPK表達顯著上調。表明在高糖培養的足細胞中miR?873?5p的表達與HNRNPK表達呈負相關。mi R?873?5P通過與HNRNPK mRNA 3’UTR結合，下調HNRNPK的表達。隨后對HNRN?PK在高糖培養的足細胞中功能研究發現，干擾miR?873?5p表達的同時敲低HNRNPK表達，可以逆轉干擾mi R?873?5p表達對高糖培養的足細胞增殖促進和凋亡抑制的作用。表明miR?873?5p通過靶向HNRNPK調控高糖培養的足細胞增殖和凋亡。

綜上所述，miR?873?5p在高糖培養的足細胞中高表達，干擾miR?873?5p表達通過靶向下調HNRN?PK表達，促進高糖培養的足細胞增殖和抑制凋亡。miR?873?5p和HNRNPK可能成為DN臨床治療的潛在靶點。