SIRT1、P16和Ki67與HPV感染交互作用在宮頸病變中的應用分析

王興民,龐朗,劉斌,呂健勇,傅錦堅

（柳州市婦幼保健院1.病理科；2.預防保健科，廣西柳州545001）

宮頸癌是全球范圍內女性人群中排行第4位的常見惡性腫瘤,人乳頭瘤病毒(HPV)的感染是常見的致病因素之一[1]。某些HPV類型,尤其是高危HPV(HR?HPV)16和18,可能導致子宮頸的持續感染,引起不可逆的變化,導致原位癌,最終向浸潤性子宮頸癌發展[2]。目前篩查宮頸癌的主要手段是宮頸細胞學和HPV檢測相結合的方法,但由于兩種檢測手段的特異性不高,且因為細胞學檢查的敏感性相對較低,許多HPV陽性者需要重復進行細胞學隨訪。因此,臨床上需要更有效的標記物以對細胞學正常但HPV DNA檢測陽性者進行進一步的篩選,以期早期鑒定出有宮頸病變的婦女。已有研究顯示,沉默信息調節因子1(SIRT1)是NAD+依賴的蛋白去乙酰化酶,屬于Sirtuin家族,其SIRT1與子宮內膜癌、卵巢癌、乳腺癌和子宮頸癌等女性生殖器官腫瘤的發生發展關系密切[3?6]。而P16/Ki?67雙染色細胞學正在成為一種替代的生物標志物,顯示出總體的高度敏感性和特異性,可用于鑒定高級的宮頸病變[7]。因此本研究通過檢測HPV DNA、SIRT1、P16和Ki67,以闡明上述因子在宮頸病變進展中的檢出陽性率和病毒?腫瘤蛋白表達的交互作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2016年1月-2018年12月在我院經手術治療或宮頸活檢的116名患者作為研究對象。研究對象入組前,由臨床醫師詢問研究對象并填寫《知情同意書》方可入組。本研究經柳州市婦幼保健院倫理委員會批準,批準號20140013。

1.2 病理診斷與分組

病理醫師對臨床醫師送檢的宮頸組織進行診斷,并結合免疫組化P16、Ki?67檢測情況分組將研究對象分為5組:炎癥組、低級別上皮內瘤變(LSIL)、高級別上皮內瘤變(HSIL)和宮頸鱗癌組。宮頸上皮病變細胞學的診斷標準按照文獻提及的方法進行[8],宮頸病變組織學的診斷標準按(2014年女性生殖器官腫瘤WHO分類)列明的要求進行[9]。排除有合并其他癌癥病變者、心腎功能不全者和進行放化療手術者。經診斷標準和排除標準后,共納入宮頸炎患者20人、LSIL32人、HSIL44人和宮頸鱗癌20人。

1.3 HPV DNA檢測方法

根據我院遺傳優生科報道的檢測方法[10],對116名研究對象的宮頸細胞樣本進行HPV DNA檢測,陽性者統一標注為陽性。

1.4 免疫組化檢測SIRT1、P16和Ki67

免疫組化染色使用羅氏免疫組化儀(Benmark XT);SIRT1的檢測方法參照本室報道[11]的方法進行,抗體購自ABcam公司的SIRT1羊抗人抗體;P16和Ki?67的免疫組化檢測方法參照文獻提及的方法[8]進行,試劑分別購自福建邁新生物公司和羅氏生物公司。

1.5 數據統計分析

采用IBM23.0軟件、SPSS18.0軟件進行統計分析。采用χ2檢驗/確切概率法分析4種因子的表達情況,logistic回歸模型分析腫瘤蛋白標志物與HPV感染交互作用在宮頸病變發展中的發病風險。

2 結果

2.1 研究對象的基本特征

納入的116名研究對象年齡21～68歲,平均年齡(38.5±5.1)歲。宮頸炎組、LSIL組、HSIL組和宮頸鱗癌組研究對象的年齡分布差異無統計學意義(P＞0.05)。

2.2 不同程度宮頸病變患者HPV檢出率和SIRT1、P16和Ki67表達陽性率

SIRT1在宮頸炎、LSIL、HSIL和宮頸癌患者組織的陽性率分別為40.0%、68.8%、68.2%和100.0%;P16在宮頸炎癥、LSIL、HSIL和宮頸癌患者組織的陽性率分別為0.0%、43.8%、95.5%和100.0%;Ki67在宮頸炎癥、LSIL、HSIL和宮頸癌患者組織的陽性指數分別為0.0%、87.5%、100.0%和100.0%。HPV的檢出率在宮頸炎癥、LSIL、HSIL和宮頸癌患者組織的檢出率分別為10.0%、68.8%、50.0%和70.0%。結果提示隨著疾病的發生進展,HPV陽性檢出率、SIRT1、P16和Ki67腫瘤蛋白標志物的陽性率逐漸增高(所有P值均＜0.01),見表1。

2.3 病毒?腫瘤蛋白交互作用在宮頸上皮內瘤變惡化過程中的作用

Logistic回歸模型顯示HPV分別與SIRT1和Ki67存在病毒?腫瘤蛋白表達的交互作用，導致LSIL向HSIL發展過程中的發病風險增加（P值分別為0.007、0.007）。SIRT1、P16和Ki67之間的交互作用也在宮頸上皮內瘤變惡化過程中發揮著重要作用（P值分別為0.001、＜0.001和＜0.001），見表2。

2.4 病毒?腫瘤蛋白交互作用在HSIL向宮頸癌惡化過程中的作用

Logistic回歸模型分析HPV與SIRT1、P16和Ki67的病毒?腫瘤蛋白表達交互作用，以及蛋白?蛋白交互作用，結果顯示SIRT1?HPV和HPV?Ki67的病毒?腫瘤蛋白表達的交互作用是HSIL向子宮頸鱗狀細胞癌發生發展的重要危險因素（P值均為0.045），見表3。

表1 宮頸病變患者HPV檢出率和SIRT1、P16和Ki67表達陽性率Table 1 Positive rate of HPV and expression of SIRT1,P16 and Ki67in women with cervical lesions[n(%)]

表2 宮頸上皮內瘤變惡化過程中病毒?腫瘤蛋白交互作用Table 2 Interactions of virus?tumor protein expression in the progression of cervical intraepithelial neoplasia

表3 HSIL向宮頸癌惡化過程中病毒?腫瘤蛋白交互作用Table 3 Interactions of virus?tumor protein expression in the progression of HSIL to cervical cancer

3 討論

宮頸癌是常見的婦科生殖道惡性腫瘤，從宮頸病變到宮頸癌的發生發展是多因素綜合的結果，其中研究較多的是HPV感染。HPV感染是宮頸癌及其癌前病變的主要原因之一，因而目前已有大量的研究將檢測HPV DNA作為宮頸癌的篩查工具之一［12］。本研究結果顯示，HPV DNA的陽性檢出率從慢性宮頸炎的10%上升到宮頸癌的70%，隨著宮頸病變的程度增加，HPV陽性檢出率增加，表明HPV的感染與宮頸癌的發生發展密切相關。有研究表明，在宮頸上皮內瘤變（CIN）II～III和宮頸癌患者中，HPV感染率可達到92.9%和96.5%［13］，這證實了HPV感染的嚴重程度與宮頸病變程度高度相關。

但也有研究報道，有些患者HPV感染僅為一過性的，有些HPV感染卻呈進展性惡化，研究者發現從宮頸炎癥到低級別上皮內瘤變再進展至高級別上皮內瘤病變甚至是宮頸癌變過程中，HPV的持續感染亦發生了一些轉變，包括了將病毒附加體整合到宿主細胞基因組中，以及兩種病毒癌蛋白HPV E6和HPV E7的表達增強［14］。此外，一些能夠調控HPV病毒癌蛋白表達的基因，也被證明在宮頸病變的發生發展進程中發揮著重要的作用，其中研究較多的是SIRT1。

SIRT1是HPV16 DNA復制復合體的一部分，并由HPV病毒蛋白E1和E2帶入病毒基因組［15］。另HPV E7選擇性誘導SIRT1蛋白水平升高，在通過整合的HPV病毒基因組自然表達HPV E7的SiHa細胞中，沉默E7可導致SIRT1蛋白減少［16］。上述研究情況顯示HPV E7可正調控SIRT1蛋白水平；亦即HPV病毒和SIRT1之間存在交互作用。本研究結果亦表明，隨著宮頸病變發生發展，除了HPV DNA陽性檢出率增加外，SIRT1蛋白表達陽性率和陽性水平均增加，且SIRT1?HPV的交互作用不僅僅存在于從LSIL到HSIL惡化進程，也存在于HSIL轉變為宮頸癌的進程中，提示SIRT1與HPV病毒在宮頸病變發生發展中起著重要作用。

P16是一種腫瘤抑制因子，可抑制細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）4和6，從而阻止正常細胞進入細胞周期的S期。當宮頸細胞通過HR HPV感染轉化時，HPV病毒致癌蛋白E6和E7失調，可誘導視網膜母細胞瘤（Rb）蛋白的功能失活［17］。Rb蛋白失活后，轉錄因子E2F釋放，導致P16在宮頸細胞核和細胞質中過表達［17］。因此P16的過度表達可以提示癌前宮頸病變和宮頸癌。一項薈萃分析結果顯示，宮頸病變程度由輕度向重度發展時，P16陽性表達率在CINI、CINII和CINIII中可分別達到38%、68%和82%［18］。上述的機制也許可以解釋宮頸細胞從LSIL到HSIL過程中P16和HPV之間存在交互作用，可導致宮頸上皮內瘤變惡化。與本研究結果相似，HPV16和/或18型DNA負荷與P16/Ki?67染色的結合提高了CINI和CINII病變檢測的敏感性［19］，表明聯合HPV DNA與P16免疫組化檢測，可提高宮頸病變惡化程度檢測的準確率。

Ki67細胞增殖抗原已在某些研究中提及，由于Ki67在增生性病變中的表達增加，因此被研究者推薦作為評估腫瘤進展的標志物之一［20］。該研究提示，在HPV DNA陽性的宮頸上皮內瘤變中，Ki67的免疫陽性反應代表了病變細胞的增殖活性。這種抗原在識別CIN鄰近的病變時具有實用性，因為病理工作者可根據Ki67的表達程度，將宮頸上皮內瘤變與良性病變（例如萎縮性鱗狀上皮、未成熟的鱗狀化生或過渡上皮）中的低表達區分開來。上述研究結果提示了Ki67的表達程度與HPV DNA陽性檢出率具有相關性，且隨著疾病病變程度增加而增加。在本項研究中，隨著疾病的發生進展，Ki67的陽性指數逐漸增高，且Ki67表達水平隨著宮頸病變程度加重而相應增加，這與已有研究結果相似，該研究結果表明，在組織病理學診斷中，發現Ki67表達陽性率與HSIL的相關性更高，達到80%［20］。

基于上述的HPV檢測與Ki67和P16免疫組織化學檢測的結合，本研究發現HPV分別與SIRT1和Ki67存在病毒?腫瘤蛋白表達的交互作用的患者可被確定為HSIL發病的高危病例，此外宮頸樣本中檢出SIRT1?HPV和HPV?Ki67的病毒?腫瘤蛋白表達的交互作用是宮頸癌發病的高危因素。上述情況顯示HPV DNA陽性、P16、Ki67表達、以及病毒?腫瘤蛋白表達的交互作用與宮頸病變的嚴重程度有關，臨床工作者可通過宮頸病變的組織病理學診斷和宮頸樣本的HPV檢測結果，用于預測宮頸病變進展、根據檢測結果進行早期干預或確定隨訪策略的有用生物標志物。