2015-2019年分離的SA菌株臨床分布、藥敏檢測及基因分型特征分析

張迪，張春麗，牛雷，樓小偉，邱紅

（1.中國人民解放軍東部戰區總醫院秦淮醫療區檢驗科，江蘇南京210002；2南京醫科大學附屬友誼整形外科醫院中心實驗室，江蘇南京210002）

金黃色葡萄球菌（SA）是醫院感染常見致病菌，以急性、化膿性為主要感染特征，其臨床分離株中有多種毒素及侵襲性酶類，致病力極強，可導致局部皮膚軟組織化膿性感染、肺炎、心包炎、腸炎、敗血癥等多種嚴重感染類型，增加住院患者病死率[1?2]。近些年來，隨著抗生素的不合理應用，以及中心靜脈置管、透析、介入手術等侵入性操作應用對機體防御機制的影響，SA感染及耐藥菌株檢出率均呈上升趨勢，給醫院感染控制帶來重大挑戰[3]。本研究調查了本院2015-2019年共1 048株SA菌株，通過了解其臨床分布特征、耐藥性以及耐藥基因情況，旨在為醫院進行針對性感染防控提供參考。

1 資料與方法

1.1 菌株來源

收集東部戰區總醫院秦淮醫療區2015-2019年從各類臨床標本中分離出的1 048株SA菌株，剔除同一患者相同部位的重復菌株。標本來源于患者創傷分泌物、痰液、血液、中段尿、導管、引流液及其他如腔積液（胸水、腹水、盆腔積液等）、灌洗液、穿刺液、乳汁、膽汁等等，申請檢查科室包括重癥醫學科（ICU）、骨科、燒傷整形科、神經外科、呼吸科等多個科室。

1.2 細菌鑒定及藥敏試驗

SA標本采集、分離參照第3版《全國臨床檢驗操作流程》，試驗菌株采用哥倫比亞血瓊脂培養基培養，選取單個菌落，通過革蘭染色及觸酶試驗證實，采取傳統劃線法接種于血瓊脂培養基分離純化，細菌鑒定及藥敏試驗采用法國梅里埃公司VI?TEK 2 Compact全自動微生物生化藥敏分析系統，革蘭陽性菌鑒定卡（GP）、革蘭陽菌藥敏卡（GP67），質控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC 25923。鑒定后的菌株于-80℃條件下保存備用。

1.3 耐藥基因檢測

金黃色葡萄球菌DNA提?。河?8～40℃水浴中快速復蘇保存菌株，移植到6 mL LB培養基過夜培養16 h；對所有接受苯唑西林藥敏試驗菌株進行耐藥基因檢測，挑選培養基單個茁壯菌落，加入離心管（內含250μL雙蒸水）充分混勻，再加入溶葡萄球菌素、蛋白酶K，于37℃條件下反應1 h，再加熱煮沸15 min，離心3 min（離心半徑8.7 cm、轉速10 000 r/min），轉移上清液到離心管，采用細菌基因組DNA提取試劑盒進行細菌DNA提取，于-20℃條件下保存。設計耐藥基因聚合酶鏈式反應（PCR）擴增引物序列，引物均由北京索萊寶科技有限公司合成（引物序列見表1），PCR儀為美國伯樂公司T100梯度PCR儀。PCR擴增反應體系：上下游引物各1μL，三磷酸堿基脫氧核苷酸（dNTPs）3.2μL，10×buffer緩沖液2μL，無菌蒸餾水5μL，MgCl 4μL，Taq DNA聚合酶0.1μL，液狀石蠟1滴，加入PCR擴增模板DNA 2μL，混勻后行PCR擴增。循環體條件：94℃下預熱3 min，94℃下變性10 min，53℃退火20 s，72℃延伸1 min，共35個循環，最72℃延伸5 min。產物分析：預先制備1.0%瓊脂糖凝膠，取4μL耐藥基因PCR擴增產物，加2μL溴酚藍混勻，于100 V電壓下電泳50 min，經凝膠成像儀記錄耐藥基因PCR凝膠電泳圖譜。

1.4 統計分析

采用EXCEL表格對數據進行整理、統計，采用SPSS 19.0軟件進行分析，計數資料用n(%)描述，采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SA的標本分布及構成比

見表2。由統計結果可知，本院2015-2019年分離出的1 048株SA菌株，標本分布前3位分別是創面分泌物標本、痰液標本、血液標本，分別占總標本比例45.71%、29.10%、8.02%。

2.2 SA的科室分布及構成比

見表3。1 048株SA菌株，科室分布前3位分別是骨科、ICU、燒傷整形科，分別占總科室分布比例19.75%、10.78%、9.73%。

表1 SA耐藥基因引物序列Table 1 Primer sequence of SA resistance gene

表2 2015-2019年分離出的1 048株SA標本分布及構成比Table 2 Sample distribution and constituent ratio of SA strains[n(%)]

2.3 SA的藥敏試驗結果

見表4。在被檢測的16種抗菌藥物中，萬古霉素、替加環素敏感率最高，整體敏感率為100%；其次為利奈唑胺、喹奴普汀/達福普汀、呋喃妥因，整體敏感率分別達99.74%、98.85%、98.20%；敏感率最差的為芐青霉素，整體敏感率僅6.89%；再者為紅霉素、氯林霉素、苯唑西林，整體敏感率分別為39.89%、50.19%、50.58%。統計分析顯示，四環素（χ2=52.715，P＜0.001）、左氧氟沙星（χ2=61.207，P＜0.001）、慶大霉素（χ2=92.266，P＜0.001）、氯林霉素（χ2=22.104，P＜0.001）、環 丙 沙 星（χ2=54.856，P＜0.001）、紅霉素（χ2=48.047，P＜0.001）、苯唑西林（χ2=26.136，P＜0.001）、莫西沙星（χ2=32.362，P＜0.001）各年度SA菌株敏感率差異有統計學意義（P＜0.05），其余各年度敏感率比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

表3 2015-2019年分離出的1 048株SA科室分布及構成比Table 3 Department distribution and constituent ratio of SA strains[n(%)]

表4 2015-2019年分離出的1 048株SA藥敏試驗結果Table 4 Drug sensitivity of SA strains[n(%)]

2.4 SA的耐藥基因分布

見表5。共1 042株SA接受耐藥基因檢測，耐藥基因mecA、er mA、ermB、ermC、aac（6′）/a ph（2″）、qa?cA整體檢出率分別為16.51%（172/1 042）、9.98%（104/1 042）、18.81%（196/1 042）、8.45%（88/1 042）、10.46%（109/1 042）、14.88%（155/1 042）；根據是否對苯唑西林敏感，分為苯唑西林敏感金黃色葡萄球菌（OSSA）組（n=527）與耐苯唑西林金黃色葡萄球菌（ORSA）組（n=515），統計學分析顯示，OSSA組mecA、ermA、aac（6′）/a ph（2″）、qac A檢出率均顯著低于ORSA組（χ2=191.864，73.946，72.746，106.455，P＜0.001），ermB檢出率均顯著高于ORSA組（χ2=164.418，P＜0.001），兩組ermC檢出率比較差異無統計學意義（χ2=2.788，P=0.095）。

表5 2015-2019年分離出的1 042株SA耐藥基因分布Table 5 Distribution of drug resistance genes in SA strains[n(%)]

3 討論

感染性疾病是全球引起人類死亡的重要原因，其中SA是當前院內感染革蘭陽性菌中居首的病原菌，其強致病性特點使得其從醫院感染擴散到社區獲得性感染，最終造成多種類型嚴重感染，威脅公共衛生，其感染防控顯得尤為重要[4?5]。

本研究從本院2015-2019年分離出的1 048株SA菌株中，主要來自患者創面分泌物、痰液、血液，占總標本比例分別為45.71%、29.10%、8.02%，這與SA普遍存在于人體皮膚、鼻咽部，容易侵襲創面、皮膚軟組織及呼吸道有關。樊芙蓉等[6]報道的632株SA，也主要來源于分泌物（49.4%）、痰液（39.4%）及血液（3.8%），與本研究類似。從臨床科室分布顯示，本院SA菌株多見于骨科、ICU、燒傷整形科，可能因為這些科室均為本院重點科室，患者基數大，且科室收治的患者疾病類型也與感染有關，如骨科以開放性骨折、手外傷、關節感染、肢體外傷等患者多見，容易合并創面感染；燒傷整形科患者則因皮膚受損、手術削痂植皮等，術前、術后創面感染風險均較大，故創面分泌物中容易檢出SA；而ICU機械通氣、深靜脈置管等侵入性操作患者多，加之患者普遍病情危重、免疫力低下，因此肺部感染、血行感染十分常見，故患者痰液、血液中相對易檢出SA。既往也有研究認為皮膚科、呼吸內科、兒科等是SA感染主要分布科室[7]，與本研究報道不同，這可能與各醫院?？铺厣炔煌嘘P。

細菌耐藥性直接關乎臨床抗感染治療成敗，SA作為常見致病菌，在臨床抗感染進程中容易顯現耐藥性。自20世紀40年代青霉素問世，SA所致感染性疾病得到了一定控制，但部分SA可產生青霉素酶，水解β?內酰胺環，對青霉素展現出耐藥性，而這一特征隨著青霉素廣泛應用日益突出，到目前能通過青霉素控制SA感染者已極少[8]。本研究對累計784株SA進行芐青霉素藥敏檢測，發現整體敏感率僅6.89%，這與盧錦沛等[9]報道的SA對青霉素耐藥率達94.12%結果類似。紅霉素、氯林霉素、苯唑西林是耐青霉素SA成本較低的備用抗菌藥物，本研究結果顯示，SA對上述3種藥物敏感率分別為39.89%、50.19%、50.58%，敏感性也較差，這提示臨床選用這些藥物時需依賴藥敏試驗結果。本研究顯示，在被檢測抗菌藥物中，萬古霉素、替加環素敏感率最高，均為100%；利奈唑胺、喹奴普汀/達福普汀、呋喃妥因次之，整體敏感率分別達99.74%、98.85%、98.20%，但這些藥物雖抗SA作用強，但往往成本較高，且濫用會增強SA耐藥性變遷風險，因此不提倡優先應用[10]。另外，本研究中SA對四環素、左氧氟沙星、復方新諾明、莫西沙星、慶大霉素等抗菌藥物敏感性70%～90%之間，提示可作為SA的經驗治療。此外，統計分析顯示，不少藥物各年度敏感率比較差異無統計學意義，部分藥物如四環素、左氧氟沙星、慶大霉素、氯林霉素等各年度敏感率雖表現出了一定波動，但并無敏感率明顯下降趨勢，說明本院SA并無明顯耐藥性變遷。

SA存在多種耐藥機制，其中菌株染色體上有mec A基因時，可編碼青霉素結合蛋白PBP2a合成，使用β?內酰胺類抗生素時，該結合蛋白無法被抑制，可正常發揮作用，使得SA得以存活，這是SA對耐藥性對β?內酰胺類抗生素耐藥的主要原因[11]。er m基因是SA對大環內酯類/林可霉胺類/鏈陽菌素B（MLSB）類抗生素耐藥的重要原因，與erm基因編碼紅霉素核糖體甲基化酶產生，使得抗生素與SA核糖體結合下降有關，主要有er mA、ermB、er mC 3種基因，其中ermA主要分布在ORSA中，而OSSA主要攜帶er mB基因[12]。aac（6′）/a ph（2″）是SA對氨基糖苷類抗生素耐藥的重要原因，耐藥機制與基因編碼氨基糖苷類藥物修飾酶有關[13]。本研究顯示，耐藥基因mec A、ermA、ermB、ermC、aac（6′）/a ph（2″）、整體檢出率分別為16.51%、9.98%、18.81%、8.45%、10.46%，此結果有助于臨床強化SA耐藥性檢測并指導相關抗菌藥應用，其中OSSA組耐藥基因mecA、ermA、aac（6′）/a ph（2″）檢出率均顯著低于ORSA組，ermB檢出率均高于ORSA組，與既往報道[14]一致。同抗生素類似，消毒劑不規范、大量應用也可導致SA產生選擇性壓力，表現出消毒劑抗性，其中qacA耐藥基因是SA發生消毒劑耐藥的主要原因，SA獲得qacA基因后對胺類如苯扎溴銨、胍類如乙酸氯已定等消毒劑出現耐藥，導致臨床消毒滅菌無效，增加SA感染風險[15]。本研究發現qac A耐藥基因檢出率為14.88%，且ORSA組更高，這一結果可為臨床SA感染患者消毒劑選擇提供參考。

綜上所述，創面分泌物、痰液及血液標本中SA分離率高，可結合患者情況作為SA檢測優先選擇標本，同時加強藥敏試驗、聯合耐藥基因檢測，有助于強化臨床耐藥性監測及抗生素應用指導。