深度創傷后瘢痕發生發展機制及干細胞來源的外泌體治療研究進展

林宇建，韓兵，麥鈺儀，時軍,3*

（1.廣東藥科大學中藥學院，廣東廣州510006；2.中國醫學科學院整形外科醫院整形九科,北京100144；3.廣東省局部精準遞藥制劑工程技術研究中心，廣東廣州510006）

外科手術、嚴重燒燙傷或皮膚穿刺等傷及真皮層的深度創傷時，皮膚易產生增生性瘢痕（hypertrophic scars，HS）。增生性瘢痕是病理性創面愈合的象征，也是機體嚴重組織損傷修復的必然產物[1]。增生性瘢痕臨床癥狀表現為不規則隆起、充血呈現紅色、質地堅韌的斑塊，會引起疼痛、瘙癢和攣縮[2]。增生性瘢痕發病率較高，研究顯示燒傷后發病率為44%[3]，手術創傷后發病率超70%[4]，已經成為影響人們生活質量的重大問題。增生性瘢痕嚴重者、會導致關節的功能障礙，給患者帶來了生理的痛苦，還會因外觀形象受損給患者心理和社交帶來沉重的負擔。

瘢痕的防治已成為醫學研究的熱點。目前研究認為,增生性瘢痕病理機制與成纖維細胞過度增殖、細胞因子分泌失調和信號通路異常密切相關。瘢痕的治療目前主要有手術治療，瘢痕內藥物注射治療、激光治療、放射治療、外用藥物治療、有機硅凝膠制品應用、加壓治療及物理康復綜合治療等，這些方法取得了一定的療效，但也存在各自的不足，因此至今缺乏增生性瘢痕的理想治療方法[5]。外泌體作為一種由細胞分泌的納米囊泡，廣泛參與細胞之間的交流，發揮生物學效應，在機體的生理和病理過程中扮演著重要角色。研究發現間充質干細胞來源外泌體通過轉運多種生物活性成分（特異性蛋白質、mRNA、miRNA、脂質等）進入靶細胞，調控創面修復過程的多個環節，促進創面愈合和抑制瘢痕形成，對增生性瘢痕防治有可觀的應用前景[6]。

1 皮膚深度創傷的修復過程

皮膚深度創傷修復是一個復雜和動態的過程，一般可分為止血、炎癥反應、細胞增殖分化和組織重塑、瘢痕形成階段。這4個不同但重疊的階段受到各種細胞生長因子的高度調控[7]。

1.1 止血階段

皮膚受創后血管收縮，血管內膜損傷激活血小板和血漿中的凝血系統，導致血小板聚集成團和出現纖維蛋白血凝塊，并共同構成止血栓，有效止血。同時血小板釋放多種生長因子(包括血小板衍生因子PDGF、血管內皮生長因子VEGF)，刺激內皮擴散、遷移和管型形成。巨噬細胞和單核細胞釋放白細胞介素?8(IL?8)和腫瘤壞死因子?α(TNF?α)等，在傷口部位被激活表達各種黏附分子，從而進一步促進傷口止血[8]。

1.2 炎癥反應階段

炎癥反應早期是由于纖維蛋白凝塊和血小板脫顆粒釋放趨化因子，導致大量中性粒細胞遷移至創面區域；形成中性粒細胞胞外誘捕網，抵御病原體的入侵[9]。后期巨噬細胞逐漸增多，在其中發揮核心作用。巨噬細胞分兩型[10]：M1型巨噬細胞具有殺滅病原體的功能；M2型巨噬細胞具有修復組織的功能。不同的刺激可使巨噬細胞極化，它的極化是基于T細胞亞群Th1和Th2分泌的細胞因子聯合外源性誘導的結果。前期Th1分泌的IFN?γ刺激下，巨噬細胞激激活為M1型巨噬細胞，可清除細菌、清除組織碎片，同時分泌TNF?α、IL?1、IL?6等炎癥因子，促進炎癥反應。Th2細胞因子(如IL?4、IL?13)則使巨噬細胞極化為M2型巨噬細胞，分泌表皮生長因子、血管內皮生長因子等從而促進誘導細胞外基質合成、表皮細胞再生及新血管形成[11]。

1.3 細胞增殖分化階段

在細胞增殖分化階段，由炎癥反應階段末期的炎癥細胞和上皮細胞，真皮細胞分泌大量的細胞因子包括：轉化生長因子?β1（TGF?β1）、血小板源性生長因子（PDGF）、血管內皮生長因子（VEGF）等誘導了血管生成、成纖維細胞的遷移和增殖分化。促進了細胞外基質形成了富含新生血管的肉芽組織，并逐漸上皮化[12]。

1.4 組織重建、瘢痕形成階段

組織的重建由新形成的肉芽組織為主體，在此階段成纖維細胞和成肌纖維細胞形成暫時性的細胞外基質，主要為膠原蛋白形式，還有纖維蛋白、透明質酸和蛋白聚糖等。含有肌動蛋白絲的肌成纖維細胞具有收縮特性，并隨著時間的推移有助于使傷口邊緣聚集在一起。隨后過量的細胞外基質的主要成分膠原蛋白III會降解并重塑為成熟的膠原蛋白I，最后形成與正常皮膚組織張力相仿的無細胞瘢痕組織[13]。

2 增生性瘢痕的發生發展分子機制

增生性瘢痕形成基礎是創傷修復過程中成纖維細胞變質異型化而過多增殖，以膠原為主的細胞外基質成分大量沉積[14]。增生性瘢痕目前研究認為是生長因子和信號通路等多種因素共同參與形成，如圖1所示。增生性瘢痕的分子信號通路的研究，有助于進一步闡明增生性瘢痕的發病機制，為藥物防治增生性瘢痕提供理論依據。

2.1 TGF?β1/Smads信號通路

TGF?β最初從血小板中分離獲得，可促進成纖維細胞的轉化生成，參與傷口愈合的全過程，是目前已知與增生性瘢痕關系最密切的細胞因子[15]。

TGF?β1/Smads信號通路是目前公認的瘢痕形成機制中的主要信號轉導通路。Smads蛋白家族是細胞內信號轉導蛋白，位于TGF?β1/Smads信號通路中TGF?β1的下游，介導TGF?β1信號在細胞內傳導。當機體受創時，TGF?β1先與TGF?β受體2（TGFR2）結合，然后募集并激活TGFR1。TGFR1活化后使Smad2和Smad3磷酸化，后者與Smad4結合并轉運至細胞核，并促進目的基因在核內轉錄，導致成肌纖維細胞的激活和細胞外基質的沉積。同時Smad6和Smad7可拮抗Smad2/3的磷酸化，抑制TGF?β家族的信號轉導，起到負反饋調節作用[16]。

現今有不少研究通過抑制TGF?β1/Smads信號通路來減少纖維化，有研究[17]使用脈沖染料激光調節TGF?β1/Smad3信號通路，促進成纖維細胞凋亡并改善了瘢痕增生。周忠志等[18]發現積雪草苷通過通路調節膠原纖維及TGF?β1表達，減少兔耳增生性瘢痕組織。在褪黑素在糖尿病性心肌病的模型中發現，褪黑激素的給藥通過抑制TGF?β1/Smads信號轉導，產生抗纖維化作用并減少了膠原蛋白的產生，顯著改善了心臟功能障礙[19]。表明TGF?β1/Smads信號通路在抗纖維化和增生性瘢痕機制上有重要作用，可以成為防治增生性瘢痕的突破口。

圖1 增生性瘢痕形成機制Figure 1 Mechanism of hypertrophic scar formation

2.2 MAPK信號通路

絲裂原活化蛋白激酶(m itogen?activated protein kinase，M APK)是信號從細胞表面傳導到細胞核內部的重要傳遞者，在細胞外刺激下通過MAPK級聯反應，將信號轉導至胞內及核內而影響細胞增殖、發育、老化及凋亡等生物學反應[20]。MAPK起著樞紐作用，目前研究認為細胞外信號調節激酶1/2(ERK1/2)和p38信號通路受到抑制或過度激活會導致傷口延遲愈合或瘢痕形成。

ERK廣泛存在于各種組織，參與細胞的增殖分化的調控。胡瑜[21]研究表明ERK1/2蛋白信號在新生鼠肺纖維化中，是調控成纖維細胞增殖，轉化及遷移的重要轉導信號。有研究發現在成纖維細胞增殖過程中ERK1/2活性異常[22]，而另一項研究結果表明，表兒茶素能降低成纖維細胞中活性ERK1/2的蛋白表達，抑制了成纖維細胞增殖[23]。此外，有研究通過A型肉毒毒素來抑制ERK/MAPK信號通路而使得成纖維細胞凋亡增加，Ⅰ型膠原蛋白分泌減少[24]。表明增生性瘢痕的發生機制與ERK1/2MAPK信號通路密切相關。

P38/MAPK是真皮成纖維細胞中膠原蛋白合成的正向調節劑，也是TGF?β1的介質，可刺激細胞外基質的產生。在p38/MAPK抑制劑作用下，會導致α?SMA和TGF?β1的誘導作用降低。Shuo等人發現roscovitine通過抑制糖尿病小鼠的TGF?β1/p38MAPK途徑，達到抗纖維化作用，對糖尿病腎纖維化有保護作用[25]。有實驗通過p38 MAPK和ERK1/2抑制劑緩解了納米NiO誘導的細胞膠原形成以及MMPs/TIMPs失衡，提示MAPK通路在膠原形成中有著重要作用[26]。此外有研究顯示脂肪組織干細胞可通過p38/MAPK途徑，降低膠原蛋白的表達[27]。

2.3 Wnt/β?catenin信號通路

Wnt/β?catenin信號通路是一條高度保守的信號途徑，調控著胚胎發育以及成年人體內細胞生長、遷移、分化的平衡，被認為是皮膚傷口愈合的重要途徑[28]。創傷等誘因激活Wnt通路，Wnt蛋白與細胞膜上Frizzled受體結合，經過細胞內一系列反應。β?catenin的降解被抑制，進而轉位至細胞核中，激活Wnt靶基因的轉錄表達[29]。

β?catenin異常可導致纖維組織過多和瘢痕形成。有研究[30]發現在Wnt/β?catenin信號中響應的lncRNA，影響了纖維化的關鍵標志物的表達，增強了膠原的收縮，表明可能與調節真皮成纖維細胞的行為和真皮纖維化中膠原的積累有關。還有報道通過局部應用小分子Wnt抑制劑對Wnt/β?catenin信號通路抑制，可以減少瘢痕并促進再生性皮膚傷口修復[31]。表明Wnt/β?catenin信號通路是影響瘢痕形成的重要機制。Wnt/β?catenin信號轉導通路還與TGF?β/Smads信號轉導通路相互調節作用形成瘢痕。既發現真皮成纖維細胞表型轉化中，TGF?β1可能通過上調Wnt配體分子，激活Wnt/β?catenin信號通路，直接在蛋白水平活化β又發現外源活化Wnt/β?catenin可以抑制TGF?β1誘導的真皮成纖維細胞表型轉化，對TGF?β1誘導的成纖維細胞表型轉化起負反饋調控作用[32]。提示Wnt/β?catenin信號轉導通路通過影響TGF?β1參與增生性瘢痕的發生。

2.4 PI3K/AKT信號傳導通路

PI3K屬于一種胞內磷脂酰肌醇激酶，與v?src和v?ras等癌基因的產物相關，且PI3K本身具有絲氨酸/蘇氨酸激酶的活性，也具有磷脂酰肌醇激酶的活性。AKT是一種絲蘇蛋白激酶，參與多種細胞生命活動，作為PI3K最重要的下游激酶，在調節細胞的增殖、凋亡與分化等生理過程中發揮重要作用。

有研究三七皂苷Ft1通過PI3K/Akt/mTOR信號通路促進成纖維細胞增殖，并促進了遺傳性糖尿病小鼠的傷口愈合[33]。同樣，在博萊霉素誘導的肺纖維化的模型中，PI3K/AKT被激活導致肺成纖維細胞增殖，而PI3K抑制劑治療可減少成纖維細胞增殖并改善肺功能[34]，表明PI3K?Akt通路與成纖維細胞增殖分化密切相關。隨著miRNA調控基因表達的作用被發掘，越來越多的人關注miRNA對瘢痕通路的關系。有研究發現miRNA?155通過PI3K/AKT途徑靶向缺氧誘導因子?1α，可抑制增生性瘢痕成纖維細胞的形成[35]。還有He等報道miRNA?494可靶向PTEN，抑制PI3K/AKT途徑以減輕增生性瘢痕的形成[36]。

3 外泌體防治增生性瘢痕

外泌體(exosomes)是細胞內多囊泡體與細胞膜融合后分泌至細胞外環境的納米囊泡，參與細胞間通信，細胞增殖，細胞遷移和免疫調節等過程，在機體的生理和病理過程中發揮極其重要的作用[37]。現在已經成功從多種類型的細胞培養上清液中提取分離出了外泌體，如神經元細胞、間充質干細胞、成纖維細胞、內皮細胞、巨噬細胞等[38]。

外泌體具有易于體外擴增、低排斥反應和良好的靶向性等優勢，是近年來興起的一種極具發展潛力的生物技術產品，在皮膚組織再生中具有顯著的臨床應用前景。多種干細胞外泌體可預防損傷后皮膚組織過度增生和瘢痕形成，研究發現人臍帶間質干細胞外泌體（huc?MScs Exo）能夠加快深Ⅱ度燙傷皮膚愈合，預防損傷后皮膚過度增生和瘢痕形成。2018年4月，FDA批準了Aegle Therapeutics公司首個EV新藥AGLE?102的申請，用于燒傷和大皰性表皮松解癥患者的治療，目前正在進行臨床試驗。

外泌體富含特殊的生物分子、功能蛋白和核酸，包括miRNAs、mRNAs，甚至DNA[39]。受體細胞可以通過膜融合、胞吞作用或者細胞特異性的吞噬作用攝入外泌體[40]。其中間充質干細胞旁分泌的外泌體，具有來源細胞特性，通過基因轉錄，向靶細胞投遞蛋白、mRNA、mi RNA等信號分子，通過調節炎癥、促進細胞增殖、血管再生及抑制瘢痕形成等多途徑在皮膚創傷修復中起到關鍵作用，如圖2所示。

3.1 調控炎癥發展

皮膚組織受損之后，身體會做出自我防御機制，引起炎癥反應，同時也伴隨著炎性因子分泌的變化。良好的炎癥反應會有助于創傷的恢復，但是過度的炎癥反應可能皮膚會形成增生性瘢痕，損害器官功能。據研究發現，干細胞來源的外泌體可以抑制由熱應激引起的炎癥反應，能調節免疫細胞中各種炎癥因子的分泌如抑制腫瘤壞 死 因 子（TNF?α）、白 細 胞 介 素IL?1β、干 擾 素γ（IFN?γ）、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)等的表達，促進抗炎因子IL?10的表達[41]。此外有研究巨噬細胞來源的外泌體在糖尿病大鼠模型中，可抑制促炎酶和細胞因子的分泌發揮抗炎作用，并加速傷口愈合，為糖尿病創傷修復開拓了新的治療方向[42]。

圖2 外泌體修復皮膚的作用機制Figure 2 Function mechanism of exosome repair of skin

3.2 調控成纖維細胞增殖

細胞增殖是創面修復的關鍵環節，外泌體能夠在其中積極發揮調控作用。有研究發現在大鼠皮膚燒傷模型中人臍帶間充質干細胞來源（human umbilical cord mesen?chymal stem cells,hucMSCs）的外泌體可以以劑量依賴的方式促進真皮成纖維細胞的增殖、遷移，促進創面愈合。在受到體外熱應激后，hucMSC外泌體可激活AKT通路，減少熱應激誘導的皮膚細胞凋亡。另外還發現，hucMSC外泌體中的Wnt4可激活β?catenin通路，促進細胞核抗原、細胞周期蛋白D3、N鈣黏素和I型膠原的表達增加，增強成纖維細胞的增殖[43?44]。王曉[45]發現胎兒真皮間充質干細胞外泌體(FD MSC?Exo)有增強成人真皮成纖維細胞的增殖、遷移、合成ECM的能力，可以促進小鼠背部皮膚創面愈合。同樣在人羊膜間充質干細胞外泌體（hAMSC?Exo）的劃痕實驗中發現過表達miR?135a后，hAMSC?Exo促進成纖維細胞遷移能力增強，而敲減miR?135a后促進成纖維細胞遷移能力減弱，表明hAMSC?Exo中的miR?135a對促進成纖維細胞遷移起關鍵作用[46]。

3.3 促進血管再生

血管新生能夠為組織和器官提供足夠養分，對修復創面有著重要的作用。間充質干細胞對促進血管生成中的作用機制仍未明確，但其外泌體可能是這環節中的重要參與者。相關研究表明干細胞來源的外泌體可直接被內皮細胞攝取，或可間接上調血管生成相關的生長因子、細胞因子等的表達水平作用于內皮細胞，提升內皮細胞增殖并遷移到傷口區域的能力，促進血管形成[47]。

外泌體中富含的各種miRNA對促進血管再生有重要作用。Liang等發現人脂肪間充質干細胞源的外泌體有促進血管的形成的作用，其中的mi R?125a可以促進血管形成及相關標記物的表達[48]。miR?125a敲除后，該外泌體成血管活性被抑制。人尿液干細胞源性外泌體可以加速大鼠皮膚創傷的血管新生，促進修復與再生[49]。此外,mi RNA?6087可調控內皮細胞的分化，經血源性子宮內膜干細胞中外泌體含有的miRNA?21可調節血管生成[50?51]。

3.4 抑制瘢痕形成

細胞外基質的沉積是增生性瘢痕形成的重要因素。而外泌體可以調控細胞外基質，從而抑制瘢痕形成。在體外實驗中，外泌體激活了皮膚成纖維細胞中的細胞外調節蛋白激酶/絲裂原活化蛋白激酶(ERK/MAPK)通路，使得基質金屬蛋白酶?3(MMP3)的水平增加，從而增加MMP3與組織基質金屬蛋白酶抑制劑?1(TIMP1)的相對比例，進而促使細胞外基質的重塑。

hucMSCs外泌體不僅可以作為加快修復受損的皮膚組織，在高細胞密度情況下，外泌體源的蛋白質14?3?3ζ通過誘導YAP磷酸化抑制Wnt/β?catenin信號傳導，抑制膠原蛋白沉積，減少細胞外基質過度增生[52]。在hucMSCs外泌體在小鼠背部皮膚全層創面缺損模型中，外泌體中富 含miRNA?23a、miRNA?21等miRNAs，阻 斷TGF?β/Smad2信號通路，抑制瘢痕形成[53]。

深度創傷后創面易過度修復，在生長因子和信號通路等因素共同誘導成纖維細胞增殖和細胞外基質大量沉積，導致增生性瘢痕形成，給患者帶來許多困擾。而外泌體具有儲存穩定、高效向傷口富集而且富含多種蛋白質和miRNA，可以調節炎癥發展、調控細胞增殖、促進血管再生等方面發揮重要作用，發揮促進創面愈合與抑制瘢痕形成的雙重功效等優勢，具有良好的組織再生修復潛力。仿生型藥物遞送系統以天然微粒載體為基礎，具有良好的靶向性和低免疫原性，是近年來興起的一種極具發展潛力的藥物遞送系統。外泌體可作為一種仿生型藥物遞送系統，包載抑瘢藥物，有望實現瘢痕根治。盡管外泌體在增生性瘢痕防治方面取得了一定的成就，但仍存在諸多問題，如研究方法的標準化、作用機制的明確及應用的有效性等。加強外泌體的基礎和轉化研究，對增生性瘢痕的早期診斷及有效治療具有重要的意義。