中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜實(shí)時(shí)熒光PCR法鑒別及其應(yīng)用

（秦皇島海關(guān)技術(shù)中心，秦皇島 066004）

蜂蜜是指蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物混合后，經(jīng)充分釀造而成的天然甜物質(zhì)[1-4]。中國(guó)是養(yǎng)蜂大國(guó)，中國(guó)蜜蜂主要由意大利蜜蜂（Apis mellifera mellifera，簡(jiǎn)稱意蜂）和中華蜜蜂（Apis cerana cerana，簡(jiǎn)稱中蜂）兩大種群組成[5,6]。意蜂原產(chǎn)于歐洲和非洲，因有較高的生產(chǎn)性能，于20世紀(jì)初引入我國(guó)，現(xiàn)已成為我國(guó)飼養(yǎng)的主要蜂種[7]。中蜂是我國(guó)本土蜜蜂，已在中國(guó)繁衍了數(shù)千年，多為黑色，個(gè)體較意蜂小。中蜂所產(chǎn)的蜂蜜為中蜂蜂蜜，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，保健功能好，但是由于產(chǎn)量低，價(jià)格是普通意蜂蜂蜜的3～5倍[8]。一些不法企業(yè)和養(yǎng)蜂人趁機(jī)將意蜂蜂蜜假冒中蜂蜂蜜銷售，或?qū)⒁夥浞涿蹞饺氲街蟹浞涿壑幸源纬浜肹9,10]，這樣不僅侵害了廣大消費(fèi)者的利益，而且破壞了公平競(jìng)爭(zhēng)的蜂產(chǎn)品市場(chǎng)秩序。

因此，如何鑒別中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜是當(dāng)前蜂產(chǎn)品行業(yè)亟待解決的一大問(wèn)題。前人研究發(fā)現(xiàn)中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜在烷烴成分、王漿主蛋白種類方面存在較明顯的差異，并建立了相應(yīng)的鑒別方法。Won等發(fā)現(xiàn)王漿主蛋白MRJP1在中蜂和意蜂蜂蜜中具有不同的分子量和表面結(jié)構(gòu)[11]。Won等和Zhang等分析了中蜂和意蜂蜂蜜中的差異蛋白并制備了特異性的抗體，通過(guò)免疫學(xué)方法對(duì)二者做了鑒別[10,12]。基于蜂蠟組分差異的鑒定方法也是確定蜂蜜蜂種來(lái)源的方法之一。Zuccato等利用1H-NMR方法分析了無(wú)刺蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的氯仿提取物，發(fā)現(xiàn)蜂蠟中的特異標(biāo)記物可用來(lái)鑒別兩種蜂蜜[13]。Zhang等發(fā)現(xiàn)中蜂蜂蜜與意蜂蜂蜜的烴類特征性成分分別為三十五烯烴（17-Pentatriacontene）和三十一烷烴（Hentriacontane）[12]。

蜂蜜中含有蜜蜂的DNA，因此可用于蜂蜜的昆蟲(chóng)學(xué)來(lái)源鑒定[14,15]。以細(xì)胞色素C氧化酶為靶標(biāo)基因，Kim等開(kāi)發(fā)了一種雙重PCR法來(lái)區(qū)分韓國(guó)本土蜂蜜和歐洲蜂蜜[16]。Soares等通過(guò)設(shè)計(jì)擴(kuò)增tRNAleucox2間隔區(qū)的引物來(lái)鑒定中蜂蜂蜜，并通過(guò)建立16S rRNA靶基因的高分辨率熔解曲線來(lái)區(qū)分中蜂和意蜂蜂蜜[6]。Zhang等設(shè)計(jì)篩選了蜂種特異性引物，建立了用實(shí)時(shí)熒光PCR-SYBR Green染料法鑒別中蜂蜂蜜與意蜂蜂蜜的體系，并發(fā)現(xiàn)該DNA分析不受蜜源植物種類和蜂蜜產(chǎn)地的影響[17]。為了提高檢測(cè)方法的特異性，我們以MRJP2為靶標(biāo)基因開(kāi)發(fā)了實(shí)時(shí)熒光PCR-Taqman探針?lè)╗18,19]，通過(guò)設(shè)計(jì)特異性的引物探針來(lái)區(qū)分意蜂蜂蜜和中蜂蜂蜜，該方法操作更簡(jiǎn)便、檢測(cè)更快速，并且靈敏度高、特異性強(qiáng)，可有效解決中蜂蜂蜜摻假問(wèn)題，為維護(hù)市場(chǎng)秩序、保護(hù)消費(fèi)者和相關(guān)蜂蜜企業(yè)的合法權(quán)益提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

引物與熒光探針購(gòu)自江蘇碩世生物科技股份有限公司，TaqmanTMGene Expression Master Mix（4369016）購(gòu)自ABI公司。本文用于方法特異性和靈敏度分析的蜜蜂和蜂蜜樣品直接由蜂農(nóng)提供，用于中蜂蜂蜜真實(shí)性鑒別的樣品主要購(gòu)自淘寶網(wǎng)或京東商城，實(shí)時(shí)熒光PCR儀為ABI Steponeplus，PCR產(chǎn)物送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2 方法

1.2.1 蜂蜜和蜜蜂DNA 的提取

取15g蜂蜜樣品于50ml離心管中，加入30ml去離子水充分混勻，45℃溫育5min，6000rpm 離心10min，棄上清，向沉淀中加入2ml超純水，將沉淀充分懸起，轉(zhuǎn)移至2ml離心管中，12000rpm離心2min，棄上清，沉淀用于DNA提取，DNA提取按照CTAB法進(jìn)行。用Nano Drop 2000C（Thermo）測(cè)定DNA濃度，蜜蜂DNA的提取參照血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒（天根，DP304）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.2 引物探針設(shè)計(jì)軟件

用Primer Express 3.0軟件設(shè)計(jì)針對(duì)中蜂和意蜂的特異性引物探針，序列見(jiàn)表1。

表1 檢測(cè)中蜂和意蜂的引物與探針

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)

實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增體系為：2×TaqmanTMGene Expression Master Mix（ABI，4369016）12.5μl；ddH2O 7.5μl；上下游引物、熒光探針（10μM）各1μl；最后加入2μl的DNA模板，總體積為25μl。每個(gè)樣品做兩到三個(gè)平行，并設(shè)置陰性對(duì)照與空白對(duì)照。反應(yīng)程序?yàn)椋?0℃ 2min，95℃ 10min；然后95℃ 15s，60℃ 1min，共45個(gè)循環(huán)。實(shí)時(shí)熒光PCR利用儀器自帶的軟件進(jìn)行結(jié)果分析，根據(jù)陰性對(duì)照結(jié)果設(shè)定閾值線，擴(kuò)增曲線及樣品Ct值由軟件自動(dòng)生成。

2 結(jié)果分析

2.1 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的特異性分析

提取中蜂的基因組，分別用擴(kuò)增意蜂和中蜂的引物探針進(jìn)行PCR反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅用中蜂的引物探針有擴(kuò)增，而用意蜂的引物探針無(wú)擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物測(cè)序表明為中蜂基因片段，說(shuō)明中蜂引物探針具有特異性（圖1A）。提取意蜂的基因組，分別用擴(kuò)增意蜂和中蜂的引物探針進(jìn)行PCR反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅用意蜂的引物探針有擴(kuò)增，而用中蜂的引物探針無(wú)擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物測(cè)序表明為意蜂基因片段，說(shuō)明意蜂引物探針具有特異性（圖1B）。

圖1 中蜂（A）和意蜂（B）實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)特異性分析

提取中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜基因組，分別用擴(kuò)增意蜂和中蜂的引物探針進(jìn)行PCR反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者無(wú)交叉擴(kuò)增，進(jìn)一步表明中蜂和意蜂引物探針具有特異性（圖2）。

圖2 中蜂蜂蜜（A）和意蜂蜂蜜（B）實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)特異性分析

2.2 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的靈敏度分析

提取中蜂蜂蜜的基因組，測(cè)定DNA濃度為50ng/L，對(duì)DNA原液依次進(jìn)行10倍稀釋，共稀釋4個(gè)梯度，每個(gè)稀釋梯度取2L作為PCR反應(yīng)的模板，每個(gè)稀釋度設(shè)置三個(gè)平行，分別得到100、10、1、0.1、0.01ng樣品的擴(kuò)增曲線，結(jié)果顯示中蜂蜂蜜的最低檢測(cè)限為0.01ng（圖3）。提取意蜂蜂蜜的基因組，DNA濃度為25ng/L，對(duì)DNA原液依次進(jìn)行10倍稀釋，共稀釋4個(gè)梯度，每個(gè)稀釋梯度取2L作為PCR反應(yīng)的模板，每個(gè)稀釋度設(shè)置三個(gè)平行，分別得到50、5、0.5、0.05、0.005ng樣品的擴(kuò)增曲線，結(jié)果顯示意蜂蜂蜜的最低檢測(cè)限為0.05ng（圖4）。

圖3 中蜂蜂蜜實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)靈敏度分析

圖4 意蜂蜂蜜實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)靈敏度分析

2.3 市售中蜂蜂蜜的真實(shí)性鑒別

提取市售的54個(gè)中蜂蜂蜜樣品基因組，分別進(jìn)行中蜂和意蜂蜂蜜成分檢測(cè)，每個(gè)樣品做兩個(gè)平行，結(jié)果發(fā)現(xiàn)20個(gè)樣品為真實(shí)的中蜂蜂蜜，不含意蜂蜂蜜成分，占比為37%。32個(gè)樣品均含有意蜂蜂蜜成分，其中24個(gè)樣品為意蜂蜂蜜，不含有中蜂蜂蜜成分；另外8個(gè)樣品為混合蜜，既含有中蜂蜂蜜成分，又含有意蜂蜂蜜成分，其中RS-13、19、32號(hào)樣品以意蜂蜂蜜成分為主，RS-22、25、54號(hào)樣品以中蜂蜂蜜成分為主，RS-14、24號(hào)樣品意蜂和中蜂蜂蜜各占約50%。RS-40、49兩個(gè)樣品中蜂和意蜂蜂蜜成分均未檢測(cè)到（表2）。

表2 對(duì)市售54個(gè)中蜂蜂蜜的檢測(cè)結(jié)果

3 討論

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)以其靈敏度高、速度快、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，在基因表達(dá)水平分析、多態(tài)性研究、物種特異性檢測(cè)等方面具有廣泛應(yīng)用[20,21]。本文建立的實(shí)時(shí)熒光PCR方法對(duì)中蜂和意蜂蜂蜜DNA的最低檢測(cè)限分別達(dá)0.01和0.05ng，采用CTAB法提取的蜂蜜DNA濃度一般為幾十ng/μl，這與前人試驗(yàn)中的濃度2.3～303.9ng/μl基本一致[6]，因此完全可以滿足檢測(cè)的需求。Zhang等建立的普通PCR方法鑒別意蜂蜂蜜，檢測(cè)限為0.1ng，靈敏度要比我們的略低[17]。提取的蜂蜜基因組中既含有花粉DNA，還含有蜜蜂DNA成分，本研究以真核生物18S rRNA基因?yàn)閮?nèi)參基因來(lái)判斷蜂蜜DNA的提取效果，擴(kuò)增Ct值在15～27，說(shuō)明蜂蜜基因組提取效果較好。對(duì)中蜂蜂蜜摻假情況檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，市場(chǎng)上真實(shí)的中蜂蜂蜜僅占37%，其余均混雜不同比例的意蜂蜂蜜成分，說(shuō)明中蜂蜂蜜摻假現(xiàn)象較普遍，嚴(yán)重破壞了公平競(jìng)爭(zhēng)的市場(chǎng)秩序。本文建立的實(shí)時(shí)熒光PCR方法可為中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的準(zhǔn)確鑒別提供有效的技術(shù)支撐。此外，目前我們未對(duì)中蜂蜂蜜中的意蜂蜂蜜摻假比例進(jìn)行詳細(xì)研究，下一步將通過(guò)定量方法解決這一問(wèn)題。