腎被膜下胰島移植治療1 型糖尿病模型小鼠的研究

（廣醫科大學第一附屬醫院胃腸腺體外科，廣西 南寧 530021）

1 型糖尿病（T1DM）由于自身β 細胞免疫損傷被破壞，導致胰島素絕對分泌不足[1]。而胰島移植是可以將胰島素水平維持在生理上適當范圍內的糖尿病治療方式[2]。2000 年Edmonton 方案提出以及在臨床上的成功應用，使胰島移植在治療糖尿病方面得到廣泛關注[3]。本研究結合本課題組夏小林等[4]前期小鼠胰島腎被膜移植研究的基礎上，采用膽管逆行灌注聯合胰腺原位灌注射改良了胰腺分離消化方法，在移植過程中采用低位腎被膜開口移植技術，旨在探索新的胰島移植操作方法與方法，并對提取的胰島細胞功能及移植效果進行評價。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要試劑

1.1.1 實驗動物 選擇SPF 級，8～10 周齡的C57BL/6J雄性小鼠60 只，由廣西醫科大學動物試驗中心提供。

1.1.2 主要試劑與儀器 Hanks 緩沖液與D-Hanks 緩沖液（美國Boster 公司）；血糖儀(美國歐姆龍公司）；倒置顯微鏡（日本OLYMPUS 公司）；內徑0.58 mm聚乙烯管PE50（美國Becton Dickinson 公司）；膠原酶V、雙硫腙（Dithizone，DTZ）、臺盼藍、淋巴細胞分離液（Histopaqueo-1077）及鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）購自美國Sigma 公司；RPMI-1640 培養基及胎牛血清（四季青）；小鼠胰島素酶聯免疫吸附試驗（ELISA）（上海酶聯公司）。主要試劑的配制：①灌注液：50000 U 肝素鈉+200 U 胰島素+Hanks 液500 ml，過濾器過濾，定pH 為7.3，4 ℃保存；②消化液：6 mg 膠原酶+5 ml 灌注液，濃度為1.2 mg/ml,現配現用；③終止液：5000 U 肝素+200 U 胰島素+Hanks 液500 ml+50 ml 胎牛血清，經過濾器過濾，定pH 為7.3，4 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 胰島的分離 ①胰腺的灌注：1%戊巴比妥鈉按0.01 ml/g 腹腔注射麻醉，酒精消毒，腹部切口打開腹腔，剪斷胸骨和膈肌，翻轉肝臟至胸腔內，便于充分暴露肝門。在視顯微鏡下，找膽總管與十二指腸交匯處，在交匯處將靠近膽總管兩邊的胰腺組織各撕開一小口，用止血鉗穿過兩開口夾閉腸管，小心分離膽總管近端便于逆行灌注消化液。用胰島素注射器于近端膽總管處穿刺，用鑷子固定針頭防止針頭刺破膽總管，緩緩推注消化液1 ml，重復2 次，使胰體尾膨脹，迅速將整個胰腺連帶脾臟切除，再對胰腺進行多點灌注使胰腺尾部進一步充盈，將灌注好的胰腺放入50 ml 離心管冰盒中保存，重復操作1 次；②胰腺的消化：將灌注好的胰腺在37.5 ℃水浴箱中水浴，靈活掌握水浴時間，直至胰腺組織消化為細小泥沙狀。水浴完成后，迅速加入30 ml 終止液重懸洗滌，4 ℃、700 g，離心1 min，倒掉上清，重復1 次。

1.2.2 胰島的純化 離心管內加入5 ml 分離液，重懸混勻，將離心管大約10°角平放在冰上，順著管壁緩慢加入D-hanks 緩沖液5 ml，避免震動，再將試管緩慢豎直，可在分離液和緩沖液之間看到明顯的分離界面，調節離心機加減速全部為0，4 ℃、700 g，離心12 min，離心結束后會看到胰島細胞懸浮在兩分離液面之間，巴氏管小心吸取懸浮物至新的15m 離心管中，加10 ml 1640 培養基（含10%胎牛血清）重懸洗滌，離心機設置同上離心1 min，倒掉上清，重復洗滌1 次；挑選250 個胰島為1 組，冰上保存。

1.2.3 胰島活性、數量、純度與功能檢測 ①胰島活性測定：臺盼藍染色法，臺盼藍對活性細胞不染色，死亡細胞染為藍色。胰島細胞成活率=未染色細胞/細胞總數×100%；②胰島數量及純度測定：純度：DTZ染色計算胰島細胞純度=胰島細胞數/總細胞細數×100%。計數：將胰島細胞制成細胞懸液，用移液槍重復3 次取樣，50 ml/次，胰島數=（3 次陽性總數/3）×20×樣本量（ml），150 μm 左右大小的的胰島細胞團為1 個當量（IEQ）[5，6]；③胰島細胞功能測定：葡萄糖刺激胰島素釋放試驗測定胰島細胞功能。挑選100個50～200μm 大小，質量高的胰島細胞團，分為高糖組和低糖組，每組5 孔，分別置于含16.7 mmol/L 和3.3 mmol/l 的葡萄糖的培養基中進行培養，37.5 ℃，體積分數5%的CO2培養箱培養60 min，采集上清液，用小鼠胰島素酶聯免疫吸附試驗進行測定分析。

1.2.4 胰島移植 ①糖尿病小鼠模型的建立及分組：造模前夜間禁食10～12 h，但保證水的供應，STZ 溶液現配現用，腹腔內注射，劑量為170 mg/kg，注射后2 h 給予喂食。注射后5 d 取小鼠尾靜脈血，檢測隨機血糖，連續兩天隨機血糖＞16.7 mmol/L 認為造模成功，7 d 后選取血糖穩定的小鼠進行腎被膜下胰島移植，但要求血糖＞20 mmol/L。隨機數字表法分為空白對照組（n=13）和實驗組（n=13），為1 型糖尿病模型小鼠并給予同種異體胰島細胞腎被膜下移植；②腎被膜下胰島移植：受體小鼠麻醉消毒備皮，于左肋下取一2 cm 切口，暴露腎臟，用顯微鑷在靠近腎下極處輕輕撕開一2 mm 低位腎被膜開口，移植前腎被膜需用生理鹽水提前浸泡的細玻璃棒充分分離。將人工挑選好的一組胰島細胞用微量注射器吸入內徑0.58 mm 的聚乙烯軟管內[7，8]，低溫離心1 min使胰島細胞團聚集一起便于移植，用微量注射器將胰島細胞緩慢打入腎被膜下，電凝器燒灼低位腎被膜開口，防止胰島細胞從開口流出至腹腔，縫合肌層皮膚復溫至麻醉蘇醒。

1.2.5 胰島移植后效果評估 ①血糖檢測：術后前7天，每天隨機時間取小鼠尾靜脈血測血糖，以后每周測1～2 次血糖，如果連續2 次隨機血糖＜11.1 mmol/L，可以認為小鼠糖尿病逆轉治愈；②葡萄糖耐量檢測：移植術后第10 天，在兩組小鼠中分別隨機選取4 只小鼠做葡萄糖耐量檢測，檢測前小鼠夜間禁食但保證水供應，腹腔注射葡萄糖，劑量為2.0 g/kg，分別于0、15、30、60、90、120 min 尾靜脈取血測定血糖；③腎被膜下胰島組織評估：移植術后第29 天切除實驗組小鼠左腎，繼續監測兩組小鼠隨機血糖，并觀察胰島組織在腎被膜下大體形態，取下的左腎經4%多聚甲醛固定、脫水、包埋、切片，蘇木素-伊紅（HE）染色后觀察腎被膜下移植物的組織學形態。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.0 和GraphPad Prism8.0 軟件分析數據作圖，計量資料以（）表示，兩組間比較用t檢驗，P＜0.05 表示為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胰島產量和活性 每只小鼠可獲得（200.23±30.18）個高質量胰島細胞團；胰島細胞團經DTZ 染色后顯示純度＞90.00%；經臺盼藍染色活性良好，活性＞90.00%，見圖1。

圖1 胰島染色

2.2 葡萄糖刺激胰島素釋放試驗結果 高糖組檢測每個胰島素釋放量為（1.98±0.20）ng/胰島，低糖組檢測每個胰島素釋放量為（0.69±0.11）ng/胰島，高糖組為低糖組的2.87 倍，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.3 小鼠成模結果 15 只受體小鼠按170 mg/kg 腹腔注射STZ 后，低血糖死亡1 只，1 只血糖＜16.7 mmol/L，剩余13 只小鼠血糖值都＞16.7 mmol/L，并出現“三多一少”的現象，造模成功率為86.73%。

2.4 移植后小鼠血糖結果 移植術后實驗組血糖第1、2 天逐步下降，第3 天全部降至正常范圍內（＜11.1 mmol/L），移植術后第4、6、7、14、21、28 天兩組血糖水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；實驗組小鼠移植術后第29 天摘除左腎后血糖明顯上升，并于摘除左腎術后第2 天血糖全部＞16.7 mmol/L，兩組血糖比較，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1、表2、圖2。

表1 兩組移植術后血糖水平比較（，mmol/L）

表1 兩組移植術后血糖水平比較（，mmol/L）

表2 兩組左腎摘除術后血糖水平比較（，mmol/L）

表2 兩組左腎摘除術后血糖水平比較（，mmol/L）

圖2 兩組移植后血糖比較

2.5 葡萄糖耐量檢測結果 兩組小鼠在腹腔注射葡萄糖后血糖迅速升高，15 min 血糖值到達高峰，隨后血糖值逐步下降，在90 min 血糖值恢復到11.1 mmol/L以下，兩組不同時間血糖值比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖3、表3。

圖3 兩組葡萄糖耐量血糖比較

表3 兩組小鼠葡萄糖耐量結果比較（，mmol/L）

表3 兩組小鼠葡萄糖耐量結果比較（，mmol/L）

2.6 胰島組織學評價 實驗組左腎體式顯微鏡下見胰島細胞團明顯存在于在腎上極背膜下，并且移植物表面已有新生血管生成（圖4A 黑色箭頭所示）；移植物切片HE 染色鏡下觀察移植胰島細胞與腎實質分界模糊，部分胰島細胞仍保持團狀聚集（圖4B黑色箭頭所示），移植胰島細胞內部發現較多血細胞，說明移植物內部也有毛細血管生成（圖4B 灰色箭頭所示），說明移植物已建立血液循環存活良好。

圖4 體式顯微鏡下移植物大體觀

3 討論

雖然腎被膜胰島移植的動物模型技術早已建立，但影響移植模型成功與否的因素有很多，如胰島的分離消化，胰島細胞的產出數量、純度活性，以及術者移植操作技術是否熟練也是影響因素之一。

本實驗根據傳統腎被膜下胰島移植技術做了部分改良，在分離階段采用膽總管逆行灌注聯合離體多點注射灌注法。膠原酶原位灌注法比離體灌注可獲得較多的胰島細胞產量[9]，有些學者采用單一膽總管原位灌注法[10，11]。而本研究操作中發現，雖然原位灌注可將胰腺組織灌注充盈，但小鼠胰尾靠近脾臟部充盈程度較胰頭體部較差。本實驗采用聯合兩種方法進行灌注，在一定程度上解決了這個問題，可使整個胰腺充分膨脹，進而使胰腺組織在水浴過程中更充分消化，相比于本實驗室前期報道[4]，提高了單只小鼠胰腺組織獲取胰島細胞的數量，而且胰島細胞的活性及產生胰島素的功能也都表現良好。同時聯合灌注法可在膽總管穿刺失敗時進行補救性灌注，也可獲得一定數量的胰島細胞，節省動物成本。

移植階段有些學者采用腎上極背膜開口移植胰島[8，12，13]，而采用腎上極背膜開口極易使胰島細胞在注入時從穿刺口流出，導致腎被膜下移植量出現差異，影響后續實驗結果。改良采用腎被膜低位開口注入胰島，由于分離的腎被膜面積較大，可使胰島細胞團被腎被膜輕松包裹，從而解決了移植物從穿刺口流出這一問題。腎被膜下胰島移植是在缺氧環境下進行[14，15]，低位腎被膜開口產生的較大腎被膜移植面積，使注入的胰島細胞具有更大的活動空間，在一定程度上避免了由于胰島細胞團堆積引起的嚴重的缺氧而導致的移植物凋亡丟失。葡萄糖刺激胰島素釋放試驗結果提示提取的胰島細胞分泌胰島素水平良好；移植術后，實驗組小鼠隨機血糖在術后第3天即可全部恢復至正常水平，且能長期保持穩定，說明小鼠腎被膜下異體胰島移植可以逆轉1 型糖尿病小鼠血糖值，而葡萄糖耐量檢測結果說明移植胰島細胞團分泌胰島素能力與正常小鼠無差異。切除實驗組小鼠左腎后，小鼠血糖有明顯升高且恢復到移植前水平，說明實驗組小鼠前期的血糖下降是由移植的胰島細胞產生的胰島素引起，葡萄糖耐量測定也表明實驗組小鼠降血糖效果和正常小鼠無差異，移植后組織評價也表明移植胰島細胞能在腎被膜下良好存活，符合課題組改良移植技術后的實驗預期。

綜上所述，改進的腎被膜下胰島移植技術可以獲得更多胰島細胞量，可使移植物在腎被膜下穩定定植產生胰島素，提高模型成功率，為下一步的藥物干預篩選奠定了良好的基礎。