小反芻獸疫病毒結構與功能的研究進展

郗珊珊，張玲艷，賈偉娟，何云江，王學理

(內蒙古民族大學 動物科技學院，內蒙古 通遼 028000)

小反芻獸疫(Peste des petits ruminants，PPR)又叫做“羊瘟”，是由小反芻獸疫病毒(Peste des petits ruminants virus，PPRV)引起的一種具有嚴重危害的高度接觸性傳染病，被世界動物衛生組織(OIE)列為A類疫病。1942年Gargadennec等在西非科特迪瓦的綿羊和山羊機體上發現了一種類似于牛瘟但又和牛瘟有一定差別的疾病，1962年Gilbertt等從綿羊細胞中首次分離出PPRV，1979年Gibbs等證實了PPRV為副黏病毒科麻疹病毒屬的成員[1-2]。PPRV同屬的成員還有牛瘟病毒(Rinderpest virus，RPV)、犬瘟熱病毒(Canine distemper vieus，CDV)、海豹瘟病毒(Porpoise distemper virus，PDV)及麻疹病毒(Measles virus，MV)等。近年來，小反芻獸疫不斷出現在阿拉伯半島、中東、南亞等地，并表現出迅速蔓延的趨勢。2007年，該病首次出現在我國西藏的阿里地區，不久后新疆、甘肅、內蒙古等地不斷報道該病的發生[3-4]。PPRV的潛伏期為2～7 d，以高熱、口腔黏膜糜爛、眼部分泌物增加、白細胞數量減少、腹瀉和呼吸困難為特征。除了綿羊、山羊等動物可以被感染外，駱駝、水牛和野生反芻動物也可患病，牛和豬不表現相應的癥候反應。動物在感染PPR后還可能出現巴氏桿菌、大腸埃希菌和支原體等微生物的混合感染。該病通常在出現發熱癥狀后的4～6 d內迅速死亡，高發病率(可達100%)和高死亡率(可達90%)的發病特點給PPR的臨床預防、診斷和治療帶來了嚴峻的挑戰。在2030年前OIE和FAO已將控制和消除PPR作為一項優先處理事項[5-10]。

1 小反芻獸疫病原學

小反芻獸疫病毒全長15 948 bp，病毒粒子大多數呈圓形或橢圓形，直徑為130～390 nm，有囊膜包裹；核衣殼呈螺旋對稱，直徑約為18 nm，螺距約為5～6 nm。病毒基因組為單股負鏈無節段RNA，從3′端到5′端的基因順序為N-P-M-F-HN-L[11-12]，密碼子CTG把HN和L基因分開，密碼子CTT把N、P、M、F基因相互分開，在PPRV基因組中，只有F基因以AGGG開始，其余基因均以AGGA的序列開始[13]。N、P、M、F、HN、L這6個基因分別編碼相應的六種結構蛋白和兩種非結構蛋白，其中N蛋白(核衣殼蛋白)、P蛋白(磷蛋白)和L蛋白(大蛋白)為構成病毒蛋白的主要結構蛋白，M蛋白(基質蛋白)、F蛋白(融合蛋白)、HN蛋白(血凝素蛋白)輔助參與病毒蛋白的構成，另外C蛋白和V蛋白在副黏病毒科的所有病毒中均表現得較為保守，并與病毒在宿主體內的復制和致病性有一定的關系[14]。

PPRV只有一個血清型，可分為 4 個系，Ⅰ系主要分布在西非，Ⅱ系在尼日利亞、喀麥隆北部等地大量分布，Ⅲ系主要分布在非洲東部，Ⅳ系主要在中東和西亞地區流行[15-16]。Enchery等[17]研究發現來自一個譜系的毒株可以免受其他譜系毒株的攻擊，并且不同的PPRV毒株之間存在一定的交叉保護。

2 基因組結構及功能

2.1 核衣殼蛋白基因組結構及功能

核衣殼蛋白(N蛋白)全長1 689 bp，編碼525個氨基酸，含有1個開放閱讀框(Open reading frame，ORF)[18]。N基因有一個poly(A)尾巴，并且在3′端和5′端分別有一個長度為53 bp和43 bp的非編碼序列。N蛋白是小反芻獸疫病毒中的一個結構蛋白，在不分段的負鏈RNA病毒中尤為常見，它的作用是包裹病毒的核酸使之免受核糖核酸酶的影響，防止破壞其結構和功能。N蛋白雖不能誘導機體產生保護性免疫，但其含量最高，免疫原性最強，目前多用于小反芻獸疫病毒的診斷檢測[19]。核衣殼蛋白可以與基質蛋白共同作用促進病毒的裝配，使RNA基因組殼體化，參與P-L聚合酶復合物的形成。2019年，Zhu等[20]在研究中首次證實，N蛋白通過干擾素調節因子3(IRF 3)抑制Ⅰ型干擾素(IFN)的產生，并抑制各種病毒干擾素刺激基因(Interferon stimulated genes，ISGs)的表達，IRF 3是一種關鍵的轉錄因子，是參與先天免疫應答基因表達所必須的物質，在誘導Ⅰ型IFN合成中發揮重要作用，并且N蛋白與IRF 3相互作用能抑制TANK結合激酶1(TBK 1)和IRF 3之間的反應進而抑制IRF 3的磷酸化。另外，Ⅰ型IFN可通過誘導ISGs表達觸發細胞抗病毒反應，所以Ⅰ型IFN和ISGs在對抗病毒防御方面都是至關重要的[21-22]。有科學家發現N蛋白與P蛋白是PPRV的兩個新型IFN拮抗因子，可通過阻斷JAK-STAT信號，破壞宿主的抗病毒免疫應答起到拮抗劑的作用，顯著抑制IFN-β誘導ISRE及IFN-γ誘導的GAS啟動子的活化，從而削弱下游各種干擾素刺激基因的上調，并防止STAT1核轉位，此研究拓寬了對PPRV介導的免疫逃逸的了解，并為小反芻獸疫疫苗的研發提供了參考[23]。

2.2 磷蛋白基因組結構及功能

P基因可以翻譯出一個結構蛋白(磷蛋白)和兩個非結構蛋白(C蛋白和V蛋白)，其中磷蛋白(P蛋白)全長1 655 bp，編碼506～509個氨基酸，分子質量為54.9 kD，等電點為4.71，含有三個ORF；C蛋白和V蛋白分別包含117和298個氨基酸。P蛋白在所有蛋白中變異程度最高，其中C末端與N末端相比較為保守[24]，雖然P蛋白的氨基末端序列保守性較差，但其在基因組的復制和轉錄中是保守的。翟軍軍等[25]通過RT-PCR方法對PPRV整個P基因進行了克隆，并預測了其三級結構，表明P蛋白是由位于中間的α-螺旋及兩側的N端和C端組成，同時還對P蛋白的同源性進行了分析，研究發現PPRV與MV、CDV、及RPV的P蛋白氨基酸同源性在45.9%～50.6%之間，核苷酸同源性為60.1%～66.6%。P蛋白可以與N蛋白-RNA模板復合物結合激活轉錄，可與N蛋白和L蛋白結合成分子伴侶，使N蛋白保持為可溶狀態與病毒RNA結合并作為轉錄復合物中的輔助因子。另外，P蛋白還可與L蛋白結合形成RNA聚合酶，再與N蛋白-RNA模板共同作用形成核糖核蛋白復合體，共同參與病毒RNA的復制和轉錄，由此可見P蛋白是一種多功能蛋白，在PPRV中發揮著重要的作用[26-27]。

2.3 基質蛋白基因組結構及功能

基質蛋白(M蛋白)在小反芻獸疫病毒蛋白中是最保守的，全長1 466 bp，編碼335個氨基酸，分子量為38.1 kD。M蛋白具有三個高度保守的ORF和多個起始密碼子(AUG)及終止密碼子(TAA)，在基因的3′端有一個非編碼區，其保守性較差。M蛋白位于病毒囊膜的內部，維持著病毒粒子的形態，與N、HN和F蛋白的胞質尾端可以相互作用，對病毒具有很好的保護[28]。Wang等[29]對PPRV-N、M、HN、F這四種結構蛋白進行克隆，發現PPRV-cDNA序列可以在Vero細胞中表達，導致病毒樣顆粒(Virus like particles，VLPs)的釋放，且其釋放效率與真正的病毒粒子相似，但是在沒有M蛋白的情況下就不能導致VLPs的釋放，因此證明了M蛋白是促進VLPs裝配和釋放的必需蛋白。釋放出的VLPs的形態與真正的病毒顆粒相似，將其分別皮下注射到小鼠和山羊體內，均能誘導動物產生PPRV特異性抗體，注射的VLPs增加了病毒中和抗體的能力，同時也促進了淋巴細胞的增殖，可以作為檢測和根除PPR的候選疫苗株[30]。Liu等[31]以PPRV Nigeria 75/1基質蛋白的mRNA翻譯區為參考設計了三種不同的小干擾RNA(Small interfering RNAs，siRNA)(M59、M208、M407)，合成后轉染到Vero-SLAM細胞中，并使細胞感染PPRV，在感染36 h后M59、M407這兩種siRNA能有效地誘導細胞融合，表明siRNA介導的M蛋白改變了與病毒糖蛋白的作用關系，從而加劇了細胞融合，阻礙了病毒釋放，并最終在體外抑制病毒的復制。

2.4 融合蛋白基因組結構及功能

PPRV的融合蛋白(F蛋白)一般包括2 410個核苷酸，編碼546個氨基酸，分子量為59.3 kD，具有高度保守性。F蛋白是I型膜糖蛋白，是PPRV病毒囊膜表面的一種纖突，其中CG的含量較高，5′端有病毒的特異性序列。融合蛋白和血凝素蛋白是病毒囊膜表面的兩種糖蛋白，均可誘發保護性免疫應答，在pH為7的情況下，F蛋白將促使細胞膜與病毒囊膜發生融合[32]，NH蛋白負責與靶細胞結合，當細胞受體與病毒發生結合后，才能使病毒進入宿主細胞[33-36]。Wang等[35]通過構建的pET30a/F原核表達載體進行了免疫轉印實驗，結果顯示pET30a/F可被山羊抗PPRV Nigeria 75/1多克隆抗體識別，而不能被空載體pET30a(+)識別，說明F蛋白具有良好的免疫反應性，這種特殊的多克隆抗體為進一步研究PPRV早期感染的發病機制和PPRV-F蛋白的結構與功能特征提供了有價值的工具。PPRV-F蛋白在疫苗的研究中具有重要作用，其中Wang等[36]將PPRV-F基因插入到重組載體pSCA1中研制自殺DNA疫苗，通過免疫熒光和免疫轉印技術鑒定重組質粒pSCA1/F的抗原性，發現宿主的抗原性強弱與血清中腫瘤壞死因子和干擾素等細胞因子的水平相互對應，同時PPRV-F可誘導小鼠淋巴細胞增殖和產生特異性中和抗體，經pSCA1/F接種的小鼠在首次免疫24 h后細胞IL-2(白介素2)和細胞IL-10水平升高，干擾素和腫瘤壞死因子也從該時開始升高隨后逐漸降低，表明該疫苗可在小鼠體內成功誘導細胞免疫和體液免疫，但僅在小鼠模型中研究疫苗的效果是不夠的，應該考慮在天然宿主例如綿羊和山羊體內進行深入的研究，這可作為一種新型PPR疫苗的研發方向。Rojas等[37]利用表達PPRV-F和PPRV-HN蛋白的重組腺病毒疫苗對綿羊進行肌內接種，發現這兩種疫苗均可對動物產生12周的保護，并且誘導T細胞對同一表位產生應答，導致記憶T細胞分化，因此在動物感染PPRV后，重組腺病毒疫苗可促使T細胞擴增，對接種動物起到一定的保護效果。

2.5 血凝素蛋白基因組結構及功能

PPRV的血凝素蛋白(HN蛋白)長1 852 bp，編碼609個氨基酸，分子量為70 kD。NH蛋白是一種II型膜糖蛋白，是PPRV的兩種糖蛋白之一，以二硫鍵相連的二聚體或四聚體形式存在于病毒囊膜表面[38]，負責將病毒粒子附著在宿主受體上，通過調節病毒的吸附和侵入來決定致病性，釋放新產生的病毒顆粒。NH蛋白其N端位于病毒內部，C端位于病毒外部，組成了PPRV囊膜表面的另一種纖突，可以作為配體與受體結合，使病毒感染宿主細胞。NH蛋白有血凝素和神經氨酸酶的雙重活性，可以將病毒附著在宿主細胞表面，并裂解宿主糖蛋白的唾液酸殘基。PPRV-HN基因的過表達可以促進病毒的增殖[39]。Liang等[40]第一次在PPRV-HN基因上發現了一些基因位點，隨后Kimura等[41]報道在亞洲流行的基因型D3、D5、D9和H1中，297株同源病毒的HN基因有8個基因位點。Xue 等[42]對親環素A(Cyclophilin A, Cyp A)進行了研究，首次發現Cyp A可以通過降低肽基脯氨酰基順/反異構酶的活性來抑制PPRV在山羊細胞內的復制，但PPRV-HN蛋白可誘導宿主的溶酶體途徑來降解Cyp A，從而以促進病毒進行復制，因此可證明HN蛋白在PPRV的復制調控中有著一定的作用。在PPRV中HN蛋白與其他病毒的蛋白相比同源性最低，是最易變異的蛋白，但其抗原性最強，能誘導機體產生中和性抗體。HN蛋白存在于PPRV粒子囊膜表面，可做為宿主免疫應答的主要靶點，不僅能刺激細胞免疫，而且具有一定的體液免疫作用，是開發新一代高效基因工程疫苗的良好靶基因。Hashiguchi等[43]對同源病毒MV-HN基因受體復合物的晶體結構和功能進行了探究，發現MV-HN表面僅露出一小部分區域用于受體和抗體結合，并且大部分MV-HN單克隆抗體都被映射到該暴露的受體結合區域，表明該區域可作為表位熱點，該研究揭示了麻疹病毒的部分感染機制，這些區域位點在致病性、種間傳播及免疫反應中發揮著重要的作用。

2.6 大蛋白基因組結構及功能

大蛋白(L蛋白)全長6 643 bp，編碼2 183個氨基酸，預測分子量為247 kD，是PPRV中最長的多功能催化蛋白。L蛋白由兩個鉸鏈區分開，形成三個保守區域，區域1負責與P蛋白結合、區域2是RNA聚合酶的功能區、區域3是ATP的結合位點[44]。L蛋白可與P蛋白作用同時發揮RNA聚合酶活性，負責RNA的復制和轉錄[45]。Ansari等[46]通過使用洗滌劑破壞甘油梯度來分離純化PPRV得到RNP復合物，再用純化的RNP復合物從PPRV mRNA的核苷酸中提取出的三磷酸末端RNA檢測三磷酸酯酶(RNA triphosphatase，RTPase)活性，發現當PPRV-L蛋白存在于純化病毒的核糖核蛋白復合體中，以及在昆蟲細胞內表達的重組L-P復合物中，均具RTPase活性。此外L蛋白C末端的極小區域(aa1640～1840)可在大腸埃希菌中表達，并顯示出RTPase活性，同時還發現L蛋白RTPase的比活性高于RTPase結構域，這可能是由于L蛋白與RTPase結構域的折疊方式的差異。Baron等[47]通過敲除PPRV中整個RNA聚合酶基因，發現一個缺少L聚合酶基因的復制子可以在表達L蛋白的細胞系中復制，并且復制效率接近于親本病毒，但是由于缺少完整的L基因使這種復制子不能在其他任何細胞中復制，因此L基因的缺失會影響病毒的復制。

2.7 C蛋白基因組結構及功能

C蛋白是由P基因翻譯而來，包括117個氨基酸，是小反芻獸疫病毒所有蛋白中最小的一種，預測分子量為20.11 kD，等電點為10.73。對C蛋白進行研究發現PPRV與RPV序列長度相同，比CDV、PDV的蛋白多3個氨基酸。Yang等[48]利用羊的子宮內膜上皮細胞(EECs)進行試驗，發現PPRV可誘導EECs發生自噬反應，是由非結構蛋白C和結構蛋白N介導的，并首次表明PPRV誘導的自噬抑制了宿主細胞的凋亡，從而有助于增強病毒的復制和成熟。C蛋白可與L蛋白結合并相互作用，參與病毒RNA的合成和阻斷Ⅰ型干擾素(干擾素α、β)的產生及其信號通路的傳導[49]，到目前為止，關于PPRV-C蛋白的功能特征還不是非常清楚，有必要進行更加深入的探索和研究。

2.8 V蛋白基因組結構及功能

在麻疹病毒屬的全體成員中，不相同病毒V蛋白的長短也各有不同，其中小反芻獸疫病毒編碼298個氨基酸，CDV和RPV編碼299個氨基酸，預測分子量為32.28 kD，等電點為4.37。張海瑞等[14]模擬mRNA的編碼過程，對PPRV-P基因的保守序列(UUAAAAAGGGCACAG)進行了定點突變，即在691位點插入一個G堿基，從而獲得PPRV-V基因，與此同時研究人員對V蛋白的三級結構建模并進行預測，認為V蛋白由N-端結構域(含3個α-螺旋)、中間結構域(含多個β-轉角)和C-端結構域(存在7個半胱氨酸殘基)組成，并預測PPRV-V蛋白的主要功能是參與該病毒的復制和致病。嚴歡等[50]將獲得的V蛋白與真核表達質粒pEGFP-N2連接后轉染到Vero細胞中，通過熒光蛋白對V蛋白進行定位，發現磷蛋白及其編碼的非結構蛋白均位于胞漿內，是由于RNA病毒不能進入細胞核進行復制，所以非結構蛋白V只能在胞漿內進行表達。V蛋白可直接參與信號轉導和轉錄激活因子1(STAT 1)和STAT 2相互作用，導致宿主的IFN應答受損[23]。Chinnakannan等[51]對PPRV、RPV、CVD、MV四種病毒的V蛋白進行研究并提出了多種作用機制，發現這四種病毒的V蛋白都是Ⅰ型干擾素基因轉錄的有效阻滯劑，且與Ⅱ型干擾素誘導基因轉錄能力不同，由此證明不同病毒阻斷Ⅰ型和Ⅱ型干擾素信號傳導的機制是不同的，和它們與STAT 1的親和力不同有關，同時還發現其不但能阻斷Ⅰ型干擾素和Ⅱ型干擾素(IFN-γ)的信號通路，而且能干預干擾素相關激酶Tyk 2的磷酸化，起到抵抗干擾素的作用，這項研究表明了麻疹病毒V蛋白靶向干擾素信號通路的多個成分具備控制Ⅰ型和Ⅱ型干擾素作用的能力。

3 展 望

到目前為止，全世界已有49個國家和地區正在發生或已經發生過小反芻獸疫，該病給各國的畜牧業發展造成了一定的影響，并且還具有向其他國家蔓延擴散的趨勢。基于目前對PPRV的研究，基因突變的發生頻率也在逐年增加，自2013年至2017年以來研究發現，我國PPRV基因突變位點的數量與PPRV的流行時間呈正相關，在H基因發生突變的41個核苷酸位點中有24個導致了氨基酸序列的改變，在P基因的47個核苷酸變異位點中有26個導致了氨基酸序列的改變，表現出H基因的非同義突變率高于P基因的現象，因此持續實時監測PPRV各基因分子變異，對防控該病具有重要意義[38，52]。PPRV-H蛋白的胞外球狀頭部含有抗原表位，可作為重要的抗原蛋白，能夠刺激機體產生中和抗體，但對于我國PPRV流行毒株H蛋白氨基酸改變能否導致其抗原性改變，還需進一步研究。

對小反芻獸疫的預防仍然依賴于疫苗的研發，為此要加強對PPRV的免疫調節和致病機制的研究，雖然PPRV傳統疫苗臨床應用還存在一定的缺陷，但研發新型基因工程疫苗和DIVA疫苗仍是未來控制小反芻獸疫新流行的重要手段。