致病性與無致病性茄科羅爾斯通氏菌轉錄組測序與分析

周大祥，龍泉洲，李彥杰，鄧雪松

(1.重慶三峽學院 生物與食品工程學院，重慶 萬州 404120；2.重慶三峽醫藥高等專科學校 基礎醫學部，重慶 萬州 404120)

茄科羅爾斯通氏菌(Ralstoniasolanacearum)是一種可在全球范圍內造成嚴重危害的重要植物病原細菌，可侵染50多個科的數百種植物，其中對茄科植物的危害最嚴重，是世界上分布最廣、危害最重且最難防治的重大細菌性病害[1]。茄科羅爾斯通氏菌作為一個復雜的群體，生理分化明顯，不同寄主來源的菌株在寄主范圍、演化型(Phylotype)、生化型和致病力等細菌學特征上有很大差異[2-5]。國內外學者對茄科羅爾斯通氏菌的研究主要從分泌系統[6]、群體感應[7]、毒性基因[8]和致病力分化[9]等方面進行。最近王曉林[10]報道對青枯菌菌株Po82在銅脅迫及侵染過程中的轉錄組分析，發掘了新的銅抗性相關基因，但利用轉錄組技術全面挖掘茄科羅爾斯通氏菌致病相關基因，對其通過哪些信號通路響應致病過程還未見報道。本研究首先從染病番茄中分離出致病性和無致病性茄科羅爾斯通氏菌，進行轉錄組測序，通過基因差異表達、COG、GO和KEGG等分析方法，挖掘茄科羅爾斯通氏菌在不同致病力條件下的轉錄本差異，以期加深對茄科羅爾斯通氏菌在不同致病力條件下基因表達的理解，為進一步深入研究茄科羅爾斯通氏菌致病分子機理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 致病性茄科羅爾斯通氏菌(Ralstoniasolanacearum)(RS+)和無致病性茄科羅爾斯通氏菌(RS-)從番茄植株上分離，由西南大學植物保護學院馬貫華鑒定并饋贈。菌株在常溫下保存于滅菌蒸餾水中。

1.1.2 培養基(g/L) ①NB培養基：牛肉浸膏3，酵母浸膏1，蛋白胨5，葡萄糖10，蒸餾水加至1 000 mL，pH值6.8～7.0。②TTC培養基：蛋白胨10，酸水解酪蛋白1，葡萄糖5，瓊脂18，蒸餾水加至1 000 mL，pH 7.0，滅菌放涼后加經過濾滅菌濃度為1%的TTC(2，3，5-三苯基氯化四氮唑)5 mL。

1.1.3 主要試劑與儀器 SV Total RNA Isolation System細菌總RNA提取試劑盒(美國Promega)；PrimerScript RT reagent Kit with gDNA Eraser反轉錄試劑盒(日本Takara)；SYBR Premix Ex Tax II熒光定量PCR試劑盒(日本Takara)；TTC(2,3,5-三苯基氯化四氮唑)(北京鼎國)。常規PCR儀(C1000，美國BIO-RAD)；Quantitative Real-Time PCR儀(CFX96，美國BIO-RAD)；分光光度計(Nanodrop-2000，美國Thermo)；光照培養箱(MGC-250BP-2，上海一恒)；核酸電泳儀機(164-5050，美國BIO-RAD)；凝膠成像系統(Versadoc1000,美國BIO-RAD)；溫控搖床(MaxQ4000,美國Thermo)；超純水儀(IQ7000,美國Milli-Q)。

1.2 方法

1.2.1 測序樣品的制備及測序 將致病性與無致病性番茄茄科羅爾斯通氏菌進行TTC平板培養鑒定，注莖接種法接種番茄進一步鑒定致病性。取致病性與無致病性茄科羅爾斯通氏菌分別接種于20 mL NB培養基中，搖床培養(28 ℃，250 r/min)至A600約為0.8(以NB培養基為對照)，得到活菌懸液。取兩種茄科羅爾斯通氏菌懸液各1 mL，10 000 r/min離心30 s，棄上清，再用1 mL NA液體培養基重懸。參照SV Total RNA Isolation System(Promega)試劑盒方法提取細菌總RNA，Nanodrop-2000分光光度計檢測樣品總RNAOD260/280在1.8～2.2之間，電泳檢測樣品總RNA無明顯降解且23S條帶亮度高于16S條帶1.5倍以上，合格的總RNA可以用于轉錄組測序。

1.2.2 轉錄組數據分析 兩株菌的mRNA富集及轉錄組測序委托上海國家人類基因組南方研究中心，在Illumina HiseqTM2500中進行雙向測序。參考基因組的轉錄組數據分析，首先對raw reads進行質控和過濾，以參考基因組(茄科羅爾斯通氏菌GMI1000(序列號：AL646053.1))為參考序列，將clean reads 映射到參考基因組的編碼序列上，再利用Trinity軟件通過序列重疊方法得到重疊群(Contigs)，進一步組裝成轉錄本(Transcripts)，最后利用Tgicl軟件進行聚類去冗余得到Unigene。BIAST分別對Unigene進行差異基因表達、COG、GO、KEGG等數據分析。基于泊松分布法(PossionDis)作差異表達基因分析，篩選標準為對比組樣品間表達倍數(fold change)≥2和錯誤發現率(false discover rate,FDR)<0.001；對差異表達基因作GO 和 KEGG功能分類及富集分析，功能和通路顯著富集篩選標準均為FDR≤0.01。

1.2.3 轉錄組qRT-PCR驗證 選取轉錄組數據中4個差異表達基因，通過PrimerQuest Tool在線程序設計引物。以gyrB基因作內參(表1)，采用PrimerScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara)試劑盒進行反轉錄，SYBR Premix Ex Tax II(Takara)試劑盒進行qRT-PCR擴增，擴增平臺為CFX96 Real-Time PCR System(BIO-RAD，USA)。PCR反應程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40個循環。基因相對表達量的計算采用公式：F=2-△△Ct，其中△△Ct =(致病性茄科羅爾斯通氏菌的目的基因的Ct值-致病性茄科羅爾斯通氏菌的內參基因的Ct值)-(無致病性茄科羅爾斯通氏菌的目的基因的Ct值-無致病性茄科羅爾斯通氏菌的內參基因的Ct值)。

表1 qRT-PCR選用基因及其引物

2 結果與分析

2.1 轉錄組測序質量評估

測序質量評估報告顯示，測序數據質量合格，滿足后續分析要求(表2)。堿基質量分布、GC含量分布、堿基質量混合分布、測序飽和度和均一化分布數據合格，可以用于后續轉錄組分析。clean reads經組裝后得到5 111條Contigs，其中大多數Contigs的長度在200～2 499 bp之間，顯示測序數據組裝質量較好。

表2 測序質量控制統計信息

2.2 Contigs的COG功能分類

圖1顯示，將注釋到COG數據庫的3 336條Contigs進行蛋白直系同源分類，得到24個功能類別，分別與代謝、轉錄、翻譯、細胞運動與分泌以及信號轉導機制等相關。其中表達數目最多的基因類別是未知功能，其次分別是一般功能預測、氨基酸轉運與代謝、轉錄和能量的產生與轉化等。

圖1 Contigs的COG功能分類

2.3 Contigs的GO功能分類

GO功能分類將Contigs分為分子功能(molecular function)、細胞組分(cellular component)和生物過程(biological process)。圖2顯示，生物過程中的代謝過程、細胞過程、定位、定位建立、生物調控和刺激應答等是茄科羅爾斯通氏菌Contigs最多的種類；細胞組分中的細胞、細胞部件、高分子配合物、細胞器和細胞器組分等是Contigs富集較多的種類；生物過程中的催化活性、結合劑活性、轉運因子活性、轉錄調節活性、結構分子活性和電荷載體活性等是Contigs富集最多的種類。通過GO分析表明，代謝過程、細胞過程、定位、刺激應答、細胞、細胞部件、催化活性和結合劑活性等途徑中的Contigs可能共同參與茄科羅爾斯通氏菌對植物的侵染過程。

圖2 Contigs的GO功能分類

2.4 Contigs的KEGG功能分類

KEGG數據庫將Contigs分為代謝(metabolism)、遺傳信息處理(genetic information processing)、環境信息處理(environmental information processing)、細胞過程(cellular processes)和生物體系統(organismal systems)。通過KEGG代謝通路分析發現，共有2 672個基因注釋到27個信號通路中。其中，注釋到代謝的最多，為2 023個，占全部注釋基因的75.71%。其次為注釋到環境信息處理的膜轉運和信號轉導的基因較多，分別為169和150個。這些代謝通路中的氨基酸代謝、膜轉運、細胞運動和翻譯等可能在茄科羅爾斯通氏菌對寄主致病過程中發揮著重要作用(圖3)。

圖3 Contigs的KEGG功能分類

2.5 差異表達基因分析

表3顯示，與無致病性茄科羅爾斯通氏菌(RS-)相比，致病性茄科羅爾斯通氏菌(RS+)共發現779條差異表達基因，差異表達基因數量偏少，可能與轉錄組樣品為相同菌株不同致病性有關。其中上調表達376條，占全部差異表達基因的48.27%，下調表達403條，占全部差異表達基因的51.73%。上調表達差異倍數范圍為1.00～7.45，差異倍數均值為1.89，下調表達差異倍數范圍為1.00～6.71，差異倍數均值為2.41。上調表達基因長度范圍為141～4 500 bp，平均長度為1 003 bp，下調表達基因長度范圍為120～9 969 bp，平均長度為1 104 bp。

表3 差異表達基因的數量及表達變化范圍

2.6 DEGs的GO富集分析

為進一步認識差異表達基因的功能，在GO功能分類基礎上進行GO富集分析。圖4所示，有1 068個基因注釋到GO富集分析中的差異表達基因。其中，上調表達的差異基因按照富集程度排序，分子功能中的催化活性、結合劑活性、轉運因子活性和電荷載體活性等是茄科羅爾斯通氏菌致病時差異表達基因富集最多的種類；細胞組分中的細胞、細胞部件、細胞間區域、高分子配合物和細胞器等是差異表達基因富集較多的種類；生物過程中的代謝過程、細胞過程、定位、定位建立、生物調控和刺激應答等是差異表達基因富集最多的種類。下調表達的差異基因按照富集程度排序，分子功能中的催化活性、結合劑活性、分子感應器活性、轉運因子活性和轉錄調節活性等是差異表達基因富集最多的種類；細胞組分中的細胞、細胞部件和細胞器等是差異表達基因富集較多的種類；生物過程中的細胞過程、運動、代謝過程、刺激應答、生物調控和定位等是差異表達基因富集最多的種類。通過GO富集分析表明，青枯侵染植物時，代謝過程、調節過程、刺激應答、細胞及組分和定位等途徑中的差異表達基因可能共同參與對植物的致病響應。

圖4 DEGs的GO功能分類

2.7 DEGs的KEGG代謝通路分析

圖5顯示，有425個基因注釋到信號通路中的差異表達基因，共富集到23個KEGG二級pathway參與茄科羅爾斯通氏菌致病性響應。根據富集程度從大到小排列，前四個KEGG富集的顯著信號通路見表4，其中，富集程度用Q值表示，Q值是由P值經過FDR校正后的值，越小表示富集程度越顯著。Q值小于0.05的顯著富集的二級通路分別為細胞運動(cell motility)、膜轉運(Membrane transport)、信號轉導(signal transduction)和氨基酸代謝(amino acid metabolism)，進一步可將其顯著富集到20個三級子代謝通路中(表4)。富集結果表明，茄科羅爾斯通氏菌對寄主的響應由眾多信號通路共同參與，其作用方式可能包括增強細菌趨化性、強化鞭毛組裝能力、提高細菌分泌系統、上調雙組分信號轉導系統、調整MAPK信號通路和增強氨基酸代謝等。

圖5 DEGs的KEGG代謝通路

表4 KEGG富集的顯著信號通路

2.8 茄科羅爾斯通氏菌Ⅲ型分泌系統基因表達差異分析

通過分泌系統細菌將毒力蛋白轉運至胞外，與寄主細胞發生相互作用而產生毒性。目前為止，發現在革蘭陰性病原菌中至少存在7種不同類型的分泌系統(Ⅰ～Ⅶ型分泌系統)。轉錄組測序發現，茄科羅爾斯通氏菌Ⅲ型分泌系統的hrp基因簇中的23個基因，有16個在致病性茄科羅爾斯通氏菌中上調表達。在茄科羅爾斯通氏菌中已經注釋和假定的78個Ⅲ型分泌系統效應子中，共有68個基因出現差異表達，其中在致病性茄科羅爾斯通氏菌中有59個上調表達，9個下調表達(表5)。

表5 致病性茄科羅爾斯通氏菌表達上調T3SS分泌系統基因簇的相關基因

2.9 qRT-PCR驗證結果

隨機挑選fliC、hrpB、ripX和hrcU等4個差異表達基因進行qRT-PCR擴增，評估轉錄組測序結果的可靠性。以log2FC表示基于轉錄組和qRT-PCR分析的基因表達量變化，其中log2FC=log2[RS+表達量/RS-表達量]，設置4次重復。相關性分析結果顯示，兩種檢測方法的皮爾遜相關系數為r=0.883 9，P<0.01(圖6)，表明基于轉錄組測序分析差異表達基因的表達結果較為可靠。

圖6 相關差異表達基因的qRT-PCR與RNA-seq結果的相關性分析

3 討 論

基于高通量、高質量和低成本的基礎，Illumina測序技術以其獨特的優勢已成為越來越多國內外研究者的主要選擇[11]。本研究從自然界分離的番茄茄科羅爾斯通氏菌致病性和無致病性菌株出發，通過比較轉錄組學挖掘出的茄科羅爾斯通氏菌致病基因，對后續探究其致病機理具有非常重要的意義，并為青枯病生防菌的篩選、應用研究提供參考。

轉錄組分析結果顯示，RS-和RS+對比發現779條差異表達基因(DEGs)，其中上調表達376條，下調表達403條。差異表達基因的GO富集分析發現，代謝過程、調節過程、刺激應答、細胞及組分和定位等途徑中的差異表達基因可能共同參與青枯菌對植物的致病響應。而KEGG分析表明，代謝通路中的氨基酸代謝、膜轉運、細胞運動和翻譯等可能在茄科羅爾斯通氏菌對寄主致病過程中發揮著重要作用。信號通路富集表明，茄科羅爾斯通氏菌對寄主的響應由眾多信號通路共同參與，其作用方式可能包括增強細菌趨化性、強化鞭毛組裝能力、提高細菌分泌系統、上調雙組分信號轉導系統、調整MAPK信號通路和增強氨基酸代謝等。

鞭毛作為植物病原細菌運動的器官，保證了植物病原細菌能夠正常運動[12]，而植物病原細菌的運動導向與趨化性相關，因此，很多病原細菌的致病性又與細菌的運動性及趨化性有關[13-14]。病原菌在侵染植物時，趨化性具有重要的作用[15]。轉錄組分析顯示，與無致病性茄科羅爾斯通氏菌相比，致病性茄科羅爾斯通氏菌鞭毛組成相關基因都下調表達(motAB-FlhABCDF-flgABCDEFGIJKLMN-fliACDEFGHIJKLMNOPQRST)。而在細菌趨化性，cheABD1D3D4RWZ1等8個基因均下調表達。推測茄科羅爾斯通氏菌的運動性與趨化性降低，影響了病原菌的致病力。

菌毛具有黏附在細胞表面的能力，與植物病原菌的致病性相關，與病原菌運動性無關，失去菌毛，致病力也隨之喪失[16]。轉錄組測序分析發現，PilA、PilE2、RSp1092、RSc2675、RSc2677、RSc2678和RSc2679等菌毛相關基因表達下調，結果與茄科羅爾斯通氏菌致病力喪失一致。

目前為止，發現在革蘭陰性病原菌中至少存在6種不同類型的分泌系統(Ⅰ～Ⅵ型分泌系統)，這些分泌系統通過分泌或注射的方式釋放效應蛋白(效應子)，以刺激或干擾寄主細胞的活動，從而能夠調控一系列的病原細菌-寄主細胞的相互作用[17]。一系列復雜網絡調控茄科羅爾斯通氏菌毒力因子的表達，位于該調控網絡的核心是PhcA—LysR家族轉錄調控因子[18]。XpsR連接PhcA調控esp基因的表達，與VsrC共同激活esp基因的啟動子[7,19]。PhcA也調控作為胞外蛋白相關基因的tex基因[20]。轉錄組測序發現，茄科羅爾斯通氏菌Ⅲ型分泌系統的hrp基因簇中的23個基因，有16個基因在無致病性茄科羅爾斯通氏菌中下調表達(hrpBDFHJKXYZ-hrcCJNQSUV)。在茄科羅爾斯通氏菌中已經注釋和假定的78個Ⅲ型分泌系統效應子中，共有68個基因出現差異表達，其中有59個下調表達，9個上調表達。無致病性茄科羅爾斯通氏菌中phcA基因的表達量降低不顯著，但xpsR和tek基因表達量顯著降低，引起esp基因表達量也顯著降低，推測xpsR和tek基因影響茄科羅爾斯通氏菌的致病力。