運脾消積法治療厭食癥幼齡大鼠的代謝組學

李玉霞 史正剛?吳麗萍祁 輝陳 靜

（1.甘肅中醫藥大學中醫臨床學院，甘肅蘭州 730000；2.甘肅中醫藥大學附屬醫院兒科，甘肅蘭州 730000）

西醫認為，小兒厭食癥發病因素復雜多樣，包括飲食結構不合理、局部或系統性疾病、微量元素缺乏、中樞神經系統、胃腸運動失調、藥物和激素類物質影響等［1-3］，而直接機制在于消化酶活性減少、食欲調節中樞失調、攝食調節關鍵區域功能異常、食欲調節因子分泌紊亂等［4-5］；中醫認為，喂養不當、飲食不節是導致小兒脾胃損傷的主要原因，加上脾胃受損、先天不足、后天失養、生活環境等因素及小兒“脾常不足”的生理特點，易造成脾運胃納功能失健，從而形成厭食［6-7］。長期厭食癥將造成小兒營養不良，影響生長發育，導致其免疫力下降，使其他系統疾病的易感性增加。

西醫治療小兒厭食癥的方法包括心理輔導、補鋅、促進胃腸動力藥等，但只能改善癥狀，不能解決根本問題，并且長期使用會出現一些不良反應；中醫治療方法為運脾法，在臨床上取得了較好的療效，克服了西醫片面補鋅所帶來的不良反應［8］。其中，小兒開胃增食合劑作為運脾法治療小兒厭食癥的代表中藥制劑，臨床上表現出顯著效果［9］，但其干預機制尚不清楚。

研究表明，小兒厭食癥患者體內物質代謝可發生明顯變化，主要是由于攝食不足導致營養物質供應缺失，使得各細胞、器官、系統代謝失調，并又通過影響自身功能的正常運行而進一步加重癥狀，形成惡性循環［10］。代謝物作為基因、蛋白網絡運行的下游最終產物，其變化可反映上游基因、蛋白水平代謝通路的變化，故本實驗通過代謝組學檢測尿液中代謝物、代謝通路的變化，探索小兒開胃增食合劑治療小兒厭食癥的作用機制，為相關臨床治療提供數據參考和理論支持。

1 材料

1.1 動物 60 只離乳后1 周齡SPF 級健康SD 大鼠，雌雄各半，體質量（80±10）g，購自甘肅中醫藥大學動物實驗中心，動物使用許可證號SYXK（甘）2015-0005-62001000000354。

1.2 藥物 小兒開胃增食合劑（批號甘藥制字Z09011932）由甘肅中醫藥大學附屬醫院制劑室提供；江中健胃消食片（國藥準字Z36021464，批號17031001）購自江中藥業股份有限公司。

1.3 儀器 LC-MS 液質聯用儀（美國Thermo 公司，型號Ultimate 3000LC，Orbitrap Elite）；低溫離心機（湖南賽特湘儀離心機儀器有限公司，型號TGL-16）；超低溫冰箱（中科美菱低溫科技有限責任公司，型號DW-HL528）。

2 方法

2.1 造模 采用病因模擬法建立厭食癥模型［11］，特制飼料為將魚肉松、奶粉、玉米粉、黃豆粉、白糖、鮮雞蛋、鮮肥肉按1∶1∶1∶2∶1∶1.8∶2 比例混勻，制成餅狀，晾干，4 ℃下保存。造模組大鼠喂養特制飼料，對照組僅常規喂養，記錄每天進食量，以造模組大鼠攝食量平均下降20%～30%、體質量低于對照組10%～15%為造模成功。

2.2 分組及給藥 將造模組大鼠隨機分為模型組、陽性對照組及小兒開胃增食合劑高、低劑量組，每組12 只，按兒童、大鼠體質量的劑量倍數直接換算成等效劑量，其中小兒開胃增食合劑高劑量組（0.3 g 生藥／mL）以11.4 g／kg 劑量灌胃，低劑量組以5.7 g／kg 劑量灌胃；陽性對照組以0.45 g／kg江中健胃消食片溶液灌胃；正常組、模型組以等體積蒸餾水灌胃，每天1 次，連續42 d，

2.3 攝食量、體質量檢測 記錄每天大鼠體質量、飼料剩余量、當日飼料加入量，每天大鼠攝食量＝前天飼料加入量-當天飼料剩余量，計算大鼠每天攝食量，并在灌胃前后進行對比。

2.4 尿樣采集 末次給藥結束后，將大鼠置于清潔代謝籠中，在冰上用裝有1 mL 0.1% 疊氮化鈉（NaN3）的一次性塑料尿杯收集24 h 尿液，移液槍采集1.5 mL 上清液后轉移至離心管中，進行編號和記錄，-80 ℃下保存備用。

2.5 樣品處理 室溫下解凍尿液后，取100 μL 至1.5 mL 離心管中，加入甲醇300 μL、2-氯苯丙氨酸（內標）10 μL，混勻后在4 ℃下離心（12 000 r／min）15 min，取200 μL 上清液待測。

2.6 樣品分析

2.6.1 色譜條件 Hypergod C18色譜柱（100 mm×4.6 mm，3 μm）；流動相水（含0.1% 甲酸）（A）-乙腈（含0.1%甲酸）（B），梯度洗脫，程序見表 1；體積流量0.3 mL／min；柱溫40 ℃；進樣量4 μL；自動進樣器溫度4 ℃。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs

2.6.2 質譜條件 正、負離子模式下除了電噴霧電壓分別為3.0、3.2 kV，S-Lens RF Level 分別為30%、60%外，其余條件均為加熱器溫度300 ℃；鞘氣體積流量45 arb；輔助氣體積流量15 arb；尾氣體積流量1 arb；毛細管溫度350 ℃。

2.7 統計學分析 本研究根據等量提取后樣本混合而成QC 樣本的LC-MS 數據重復性來評價儀器穩定性，分析數據質量，并為后續樣品預處理參數設定提供依據。依據QC 樣本的保留時間和質荷比數據，對Markerview 參數進行設置，再將LC-MS 原始數據導入該軟件中進行色譜峰校準，尋找相應色譜峰及離子強度。根據80%原則及去除同位素離子獲取有意義的連續性變量，歸一化色譜峰總面積。采用SIMCA-P 13.0 軟件對上述處理后的數據進行分析，包括主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA），其中在OPLSDA 分析中得到投射變量影響值（variable importance in projection，VIP），結合在Markerview軟件中得到的t檢驗P值和倍數變化（fold change，FC）值來篩選差異代謝物，并以同時滿足VIP＞1，P＜0.05 和FC＞2 為標準篩選差異代謝物。以質譜質荷比或精確分子質量為指標搜索在線數據庫Metlin，對代謝差異物進行定性分析。采用Multiple Array Viewer 軟件，對包含峰強度信息的已鑒定差異代謝物的數據集進行HCA 分析，并生成熱圖，并通過Metabolo Analyst 3.0 軟件結合相關文獻報道對代謝通路進行分析。

3 結果

3.1 大鼠攝食量、體質量 與正常組比較，造模第7 天模型組大鼠攝食量、體質量分別降低37.5%、19.0%（P＜0.05），第28 天分別降低至40.6%、30.0%（P＜0.05），符合厭食癥模型標準，提示造模成功［12-13］。見表2。

表2 各組大鼠攝食量、體質量變化（，g）Tab.2 Changes in food intakes and body weights of rats in various groups（，g）

表2 各組大鼠攝食量、體質量變化（，g）Tab.2 Changes in food intakes and body weights of rats in various groups（，g）

注：與正常組比較，?P＜0.05。

3.2 系統穩定性、重復性試驗 對QC 樣品的總離子流色譜圖（TIC）色譜圖進行重疊，結果見圖1。由此可知，代表性離子色譜峰強度的RSD 均小于10%，TR 漂移均小于0.25 min，m／z波動范圍不超過0.000 007，表明保留時間重復性、儀器穩定性良好，所得結果具有較高的可靠性。

3.3 LC-MS 代謝譜 圖2 顯示，各組總離子色譜圖的輪廓具有一定差異。再采用SIEVE 軟件，對正、負離子模式下的色譜數據進行提取和預處理，并在Excel 2010 中進行歸一化及后期編輯，最后整理成二維數據矩陣形式，包括保留時間（RT）、分子量（CompMW）、觀察量（樣本名稱）、質荷比（m／z）、可提取物質數（ID）、峰強度等信息。本實驗在正離子模式下共得到1 539 個代謝物，負離子模式下得到4 016 個代謝物，將編輯后的數據矩陣導入SIMCA-P 13.0 軟件進行多元統計分析，找出組間具有表達差異的物質。

3.4 主成分分析（PCA）圖3 顯示，正、負離子模式下各組代謝物的總體分布均比較集中，無明顯偏離的組，即無法分辨出各組之間代謝變化的總體差異。因此，本研究采用具有更大區分能力的OPLS-DA 進行數據建模。

圖1 QC 樣品總離子流色譜圖Fig.1 Total ion current chromatograms of QC samples

3.5 偏最小二乘方判別分析（OPLS-DA）圖4顯示，與正常組比較，模型組大鼠尿液中代謝物有明顯變化；與模型組比較，小兒開胃增食合劑各劑量組大鼠尿液中代謝物有明顯變化。選擇OPLSDA 模型的VIP＞1，并結合P＜0.05 且log2FC＞1 或log2FC＜-1 作為差異代謝物的篩選標準，結合質荷比或精確分子質量搜索在線數據庫Metlin，發現與正常組比較，模型組中明顯下調的代謝物有22 個，明顯上調的代謝物有7 個，其中顯著下調的有11 個［Xanthosine、LysoPE（0∶ 0／20∶ 4）、m-Coumaric acid、cAMP、Palmitic acid、Oleic Acid、LysoPE（0∶0／18∶1）、Phloroglucinol、6-Phosphog-gluconolactone、Tartaric acid、Hexadecanedioic acid］（VIP＞1.0，P＜0.05 且log2FC＜-1），無顯著上調的（VIP＞1.0，P＜0.05 且log2FC＞1）見表3、圖 5；與模型組比較，小兒開胃增食合劑低劑量組中明顯上調的代謝物有15 個，明顯下調的代謝物有14 個，其中顯著上調的有3 個（5-Methoxytryptophan、Suberic acid、N-Acetylleucine）（VIP＞1.0，P＜0.05 且log2FC＞1），顯著下調的有3 個［Oleic Acid、LysoPE（0∶ 0／18∶ 1）、Palmitic acid］（VIP＞1.0，P＜0.05 且log2FC＜-1），見表3、圖 5；小兒開胃增食合劑高劑量組中明顯上調的代謝物有29 個，明顯下調的代謝物有19 個，其中顯著上調的有10 個（L-Homophenylalanine、Sinapic acid、2-Acetolactic acid、Ricinoleic acid、Suberic acid、3-Indoleacetic Acid、6-Phospho-g-gluconolactone、Oxaloglutarate、Mesaconic acid、N-Acetylleucine ）（VIP＞1.0，P＜0.05 且log2FC＞1），顯著下調的有6 個 ［LPA（0∶0／18∶0）、Oleic Acid、LysoPE（0∶0／18∶1）、Palmitic acid、Stearic acid、γ-Tocotrienol］（VIP＞1.0，P＜0.05 且log2FC＜-1），見表3、圖5。

3.6 代謝通路分析及其生物學意義 將有明顯差異的代謝物名稱及相對色譜峰強度數據導入MetaboloAnalyst 3.0 軟件中進行代謝通路匹配分析，結果見圖6～7。由此可知，與正常組比較，模型組具有明顯差異的29 個代謝物所涉及到的代謝通路有9 條，主要受到影響的通路包括非飽和脂肪酸和脂肪酸生物合成、苯丙氨酸代謝、甘油磷脂代謝；與模型組比較，小兒開胃增食合劑低劑量組主要是非飽和脂肪酸和脂肪酸生物合成、甘油磷脂代謝通路受到影響，而高劑量組主要是非飽和脂肪酸和脂肪酸生物合成、甘油磷脂代謝、苯丙氨酸代謝受到影響，主要涉及到氨基酸代謝、脂質代謝。

圖3 各組大鼠代謝物PCA 圖Fig.3 PCA plots for metabolites of rats in various groups

圖4 各組大鼠代謝物OPLS-DA 圖Fig.4 OPLS-DA plots for metabolites of rats in various groups

表3 各組大鼠尿液中14 種生物標志物Tab.3 Fourteen biomarkers in rat urine in various groups

圖6 具有明顯差異代謝物的代謝通路（ESI-）Fig.6 Metabolic pathways of metabolites with significant differences（ESI-）

4 討論

本研究采用病因模擬法成功制備了厭食癥模型大鼠，通過LC-MS 法對其尿液中代謝物進行代謝組學的分析，發現有29 個代謝物發生了變化，涉及9 條代謝通路；藥物干預后，與模型組比較，小兒開胃增食合劑低劑量組、高劑量組大鼠分別有29、48 個代謝物發生變化，分別涉及14、19 條代謝通路，主要是脂質、氨基酸代謝途徑。

圖7 具有明顯差異代謝物的代謝通路（ESI+）Fig.7 Metabolic pathways of metabolites with significant differences（ESI+）

4.1 潛在代謝標志物 模型組大鼠尿液中具有意義的差異代謝物包括Xanthosine、LysoPE（0∶0／20∶ 4）、m-Coumaric acid、cAMP、Palmitic acid、Oleic Acid、LysoPE（0∶0／18∶1）、Phloroglucinol、6-Phosphogluconolactone、Tartaric acid、Hexadecanedioic acid，提示小兒厭食癥模型大鼠代謝發生了明顯變化，可作為臨床診斷和評價的代謝標志物候選因子，但還需利用分子生物學手段證實。

4.2 脂質代謝途徑 脂質代謝是機體維持脂類物質平衡，影響機體正常運行的主要代謝之一［14］。本研究發現，模型組大鼠尿液中脂質代謝途徑相關物質LPA（0∶ 0／18∶ 0）、Palmitic acid、Oleic Acid、Tartaric acid 水平均顯著下降，其中Palmitic acid、Oleic Acid、Tartaric acid 均屬于脂肪酸生物合成通路的產物，LPA（0∶0／18∶0）屬于甘油磷脂代謝的產物，其濃度下降分別預示體內脂肪酸生物合成、甘油磷脂代謝通路受阻，小兒身體對脂質的吸收、利用、代謝發生障礙，但小兒開胃增食合劑干預后這2 條代謝途徑并未發生回調，反而向更失調的方向移動，其原因可能是藥物本身對脂質代謝通路的失調作出了貢獻，并且也是脂肪酸代謝受阻時機體對高脂高糖飼養的一種保護改變策略。

4.3 氨基酸代謝途徑 氨基酸代謝在小兒厭食癥模型大鼠中失調，其中苯丙氨酸代謝通路的產物苯乙醛在模型組中下調，而經小兒開胃增食合劑干預后上調。苯丙氨酸作為人體必需的氨基酸，它在模型組中代謝下調可能是由于厭食造成其攝入減少所致，而干預后其代謝上調可能是由于小兒開胃增食合劑可改善癥狀，使其攝入量趨于正常。

4.4 其他 其他物質代謝及其通路在各組大鼠中呈非線性系統性變化，具體原因還需進一步研究。