小檗皮HPLC 指紋圖譜建立及不同品種模式識別

徐鑫梅，易 歡，賴先榮，馮 圖，李 琪，蔣桂華?，范 剛?

（1.成都中醫藥大學藥學院，四川成都 611137；2.成都中醫藥大學民族醫藥學院，四川成都 611137；3.貴州工程應用技術學院生態工程學院，貴州畢節 551700）

小檗皮為小檗科植物甘肅小檗Berberis kansuensisSchneid.及其同屬多種植物的干燥內皮［1］，能清熱、解毒、燥濕，常用于治療痢疾、尿路感染、腎炎、結膜炎等疾病［2-3］。《晶珠本草》 中記載有“小檗皮性涼、糙，能斂諸毒，干黃水”［4］。現代藥理學研究發現，小檗皮可有效降低四氧嘧啶所致糖尿病模型小鼠血糖水平，能防治糖尿病小鼠視網膜病變，并能改善受損的視網膜微血管形態［5-8］。小檗皮為典型的多基原藏藥材，同屬多種植物均能入藥。課題組前期對小檗皮進行了詳細的資源調查及文獻考證［9］，發現目前各藏醫院、藏藥廠及藥材市場上使用的主流品種包括甘肅小檗Berberis kansuensisSchneid.、鮮黃小檗Berberis diaphanaMaxim.和匙葉小檗Berberis vernaeSchneid.等。小檗皮藥材的基原多樣性和混淆使用不利于市場監管，也影響其質量穩定性和臨床使用。因此，建立簡便、可行的品種鑒別方法對于小檗皮藥材的質量控制具有重要的意義。

現代研究表明，小檗皮藥材主要含有小檗堿、木蘭花堿、巴馬汀等生物堿類成分［10-12］。張琦等［13］采用HPLC 法測定了小檗皮中小檗堿的含量；莫家祺等［14］采用紫外分光光度法測定了總生物堿含量；李琪等［15］采用HPLC 法對小檗皮藥材中6 種成分進行含量測定。然而，單一成分或多成分的含量測定仍不夠全面，不能完全反映小檗皮藥材的內在質量。指紋圖譜具有信息量大、特征性強、整體性和模糊性等特點，可充分反映各成分分布的整體情況［16-18］。因此，本研究首次建立了小檗皮藥材的HPLC 指紋圖譜，運用相似度評價、主成分分析（PCA）及偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）對不同品種的小檗皮藥材進行綜合評價，以期為其基原鑒定及質量控制提供參考。

1 材料

Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；Sartorius BP121s 電子天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）；ULUP-I-10T 優普超純水機（成都超純科技有限公司）；CQ-250 超聲波清洗器（上海必能信有限公司）。

蟾毒色胺內鹽、阿魏酸4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷對照品均由本課題組自制，經HPLC 檢測純度均＞99%；木蘭花堿（批號MUST-18071701，純度＞99%）對照品購于成都曼思特生物科技有限公司；藥根堿（批號Y-023-141201）、巴馬汀（批號H-015-150808）、小檗堿（批號Y-035-150818）對照品均購于四川賽因斯特生物科技有限公司，純度均＞98%。磷酸、乙腈為色譜純；甲醇、鹽酸為分析純；水為超純水。本研究共收集15 批小檗皮，采用植物分類學及課題組前期建立的DNA 條形碼方法［9］鑒定分別為鮮黃小檗Berberis diaphana、匙葉小檗Berberis vernae和甘肅小檗Berberis kansuensis，具體信息見表1。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 WondaSil? C18-WR 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-0.2%磷酸（B），梯度洗脫（0～10 min，5%～12%A；10～15 min，12%～15%A；15～20 min，15%～18% A；20～30 min，18%A；30～40 min，18%～30%A）；柱溫30 ℃；體積流量1.0 mL／min；檢測波長210 nm；進樣量10 μL。

表1 樣品信息

2.2 對照品溶液制備 精密稱取小檗堿、巴馬汀、藥根堿、木蘭花堿、蟾毒色胺內鹽、阿魏酸4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷適量，置于5 mL 量瓶中，甲醇制成1.500、1.725、1.950、1.925、2.950、2.590 mg／mL 貯備液。分別精密量取2 mL 置于同一25 mL 量瓶中，甲醇制成每1 mL 含小檗堿0.120 mg、巴馬汀0.138 mg、藥根堿0.156 mg、木蘭花堿0.154 mg、蟾毒色胺內鹽0.236 mg、阿魏酸4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷0.207 mg 的溶液，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液制備 取藥材粉末（過3 號篩）約0.2 g，精密稱定，置50 mL 具塞錐形瓶中，精密加入鹽酸-70%甲醇（1∶100）溶液50 mL，稱定質量，超聲30 min，放冷，再稱定質量，鹽酸-70%甲醇（1∶100）溶液補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，過0.45 μm 微孔濾膜，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 空白試驗 取鹽酸-70% 甲醇（1∶100）溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣，發現溶劑對小檗皮指紋圖譜測定沒有干擾。

2.4.2 完整試驗 取樣品（S15）約0.2 g，精密稱定，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣，記錄120 min 的色譜圖。結果，60 min 后未出現色譜峰，可完整記錄小檗皮樣品各化學成分信息。

2.4.3 精密度試驗 取樣品（S15）約0.2 g，精密稱定，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下連續進樣6 次。結果，以木蘭花堿為參照峰時，各共有峰相對保留時間RSD＜0.6%，相對峰面積RSD＜2.9%。將其色譜圖導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件（2004 年A 版）進行評價，發現其相似度均大于0.999，表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩定性試驗 取樣品（S15）約0.2 g，精密稱定，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下于0、1、2、3、4、6、12、24 h 進樣。結果，以木蘭花堿為參照峰時，各共有峰相對保留時間RSD＜0.6%，相對峰面積RSD＜3.0%。將其色譜圖導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件（2004 年A 版）進行評價，發現其相似度均大于0.999，表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.4.5 重復性試驗 取樣品（S15）6 份各0.2 g，精密稱定，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣。結果，以木蘭花堿為參照峰時，各共有峰相對保留時間RSD＜2.9%，相對峰面積RSD＜3.0%。將其色譜圖導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件（2004年A 版）進行評價，發現其相似度均大于0.975，表明該方法重復性良好。

2.5 樣品含量測定 參照課題組前期建立的HPLC 含量測定方法［15］，對15 批樣品6 種成分含量進行測定，并將結果導入SIMCA-P 14.1 軟件進行主成分分析（PCA）和偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）。PCA 模型自動擬合選擇了4 個主成分，其累計貢獻率為94.6%，PCA 得分圖見圖3A，可知鮮黃小檗和匙葉小檗不能得到有效的區分。此外，PLS-DA 分析參數分別為R2X ＝84.6%、R2Y ＝81.3%、Q2＝43.0%，表明模型良好；PLS-DA 得分圖見圖3B，與PCA 結果相似，兩者仍然不能得到明顯的分類。

2.6 HPLC 指紋圖譜建立及相似度評價

2.6.1 參照峰選擇 木蘭花堿為小檗皮質量評價的重要指標之一，每批樣品中均含有這種成分，其色譜峰在色譜圖中分離度良好，峰面積最大，保留時間和峰面積較為穩定，故選擇其作為參照峰。

2.6.2 指紋圖譜建立 15 批藥材按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣，其色譜圖以AIA 格式導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件（2004 年A 版）。將S1 號樣品的圖譜設為參照圖譜，采用中位數法，時間窗寬度設為0.5 min，進行多點校正和色譜峰匹配，最終確定了13 個共有峰，得到指紋圖譜疊加圖，并生成對照指紋圖譜，見圖1。

圖1 15 批樣品HPLC 指紋圖譜

2.6.3 共有峰確認 將小檗皮對照指紋圖譜與標準品圖譜比對，指認了其中6 個共有峰，分別為蟾毒色胺內鹽（2號峰）、阿魏酸4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（4 號峰）、木蘭花堿（6 號峰）、藥根堿（11 號峰）、巴馬汀（12 號峰）、小檗堿（13 號峰），見圖2。以木蘭花堿（6 號峰）作為參照物峰（S），指定其相對峰面積值為1.000，計算指紋圖譜中其他共有特征峰的相對峰面積比值，見表2。

圖2 小檗皮中各成分色譜圖

表2 15 批樣品指紋圖譜共有峰相對峰面積

2.6.4 相似度評價 將15 批藥材的HPLC 指紋圖譜數據導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件（2004 年A版）進行相似度評價。結果，除S5 相似度為0.779 外，其余樣品均大于0.85，其中鮮黃小檗0.895～0.956，匙葉小檗0.779～0.962，甘肅小檗0.955～0.964，大多數樣品相似度較高，表明不同品種之間成分組成相似，見表3。

表3 15 批樣品相似度

2.7 模式識別 將15 批樣品的13 個共有色譜峰的峰面積導入SIMCA-P 14.1 軟件進行模式識別分析，包括PCA 和PLS-DA，數據采用自動規格化處理后，首先用無監督模式識別方法觀察樣品的自然聚集。模型自動擬合選擇了4 個主成分，其累計貢獻率為81.4%，表明前4 個成分能反映原始數據81.4%的信息。所有樣品的PCA 得分圖見圖3C，可知3 個基原的小檗皮樣品被明顯分為3 類。

為進一步驗證小檗皮不同品種之間的差異，采用有監督的模式識別方法（PLS-DA）對所有樣品進行模式識別分析。結果，PLS-DA 模型參數為R2X ＝76.0%，R2Y ＝97.2%，Q2＝86.6%，表明建立的模型較穩定且預測性良好。PLS-DA 得分圖見圖3D，可知分類結果與主成分分析結果一致，3 個品種被明顯聚集在不同區域。由此表明，各品種之間成分組成存在一定的差異。

3 討論

3.1 色譜條件優化 考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.2%磷酸、乙腈-0.2%磷酸流動相系統，結果表明以乙腈-0.2%磷酸洗脫時主要色譜峰的分離度明顯提高，且峰形較好，保留時間適中。考察了210、230、256、270、300 nm等不同波長下的吸收圖譜，發現在210 nm 波長下色譜峰信息多，峰型良好，吸收較強。此外，還考察了色譜柱、柱溫等條件，最終確定為“2.1”項下條件。

圖3 15 批小檗皮樣品PCA、PLS-DA 分析得分圖

3.2 提取條件優化 考察了冷浸、回流、超聲3 種不同提取方法，結果表明超聲提取效率高。考察了30% 甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇及鹽酸-70%甲醇（1∶100），發現70%甲醇提取效果較好，加入1% 鹽酸后部分色譜峰峰型改善，提取效率提高。考察了15、30、60 min 提取時間，發現60 min 提取率接近30 min，高于15 min，最終選擇超聲30 min 提取。考察了20、50、100 mL 提取溶劑用量，發現50 mL 溶劑可充分提取藥材中的化學成分，并且各成分在色譜圖上具有適合的響應值。

3.3 模式識別分析 本研究采用HPLC 法建立了小檗皮化學指紋圖譜，并以6 號峰木蘭花堿為參照峰，確定了13 個特征峰，鑒定了其中6 種成分，能全面反映藥材內在質量。大部分藥材樣品的相似度均大于0.85，表明所建立的HPLC 指紋圖譜可用于小檗皮質量控制。

15 批樣品HPLC 圖譜輪廓基本一致，但共有峰峰面積相差較大。因此，在HPLC 指紋圖譜的基礎上本研究對其進行PCA 和PLS-DA 分析，發現2 種模式識別方法均能很好地區分3 個品種，而以6 種成分含量為指標時不能得到明顯的分類。綜上所述，HPLC 指紋圖譜結合模式識別方法可有效區分小檗皮不同基原品種，表明體現整體性的HPLC 指紋圖譜能更好地檢測各成分的種間變化，可為該藥材基原鑒定和質量控制提供參考。