HMBR內微生物群落結構分析及功能菌脫氮機理

李 瑩，史浩辰，劉 強，鄭曉英，鄭嘉雄，項 瑋，曲吉祥

(1.徐州工程學院環境工程學院，江蘇 徐州 221018；2.淺水湖泊綜合治理與資源開發教育部重點實驗室，河海大學，江蘇 南京 210098； 3.河海大學環境學院，江蘇 南京 210098；4.陸軍工程大學，江蘇 徐州 221000)

膜生物反應器(membrane bio-reactor,MBR)因具有低成本、處理效果顯著等特點，被廣泛應用于污水處理中[1]。很多學者對MBR的運行效果、反應器內部的微生物群落結構及功能菌開展了研究[2-3]，發現整個系統中存在著豐富的亞硝化菌、硝化菌和反硝化菌，微生物類群在好氧段中與硝化過程中非常豐富，而在缺氧段與反硝化相關的微生物較多。

將懸浮填料與MBR有機結合的復合式膜生物反應器(hybrid membrane bioreactors,HMBR)工藝，除了具有活性污泥和MBR的優點外，還能提高各種污染物的去除效果[4]。關于HMBR的研究大多著眼于其污水處理效果[5-6]，而對于HMBR工藝反應器內不同作用單元(微濾膜、懸浮填料、活性污泥混合液)中微生物的多樣性和群落結構差異，以及從微生物功能角度解析污染物脫氮機理的研究較少[7]。因此本文以脫氮菌為分析對象，通過分析比較HMBR裝置內不同位置所含活性污泥內微生物群落結構，以期為脫氮機理的研究提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 試驗裝置

HMBR系統見圖1，該反應器為有機玻璃材質，有效容積為1.0 m3。反應器中填料投加百分比為50%，反應器中污泥取自某污水廠二沉池的回流污泥。該系統膜組件由PVDF材料制成，膜孔徑為0.2 μm，膜面積為1.0m2，膜通量為10.0 L/(m2·h-1)，采取間歇交替運行的方式，每運行4 min暫停2 min。試驗過程中控制該反應裝置內部環境的pH值為7.5左右，DO控制在4.0 mg/L，溫度為20℃。根據之前的研究結論[8]，反應器的最佳運行工況水力停留時間(HRT)為10 h，污泥停留時間(SRT)為30 d。

圖1 復合式膜生物反應器裝置構造示意

1.2 試驗用水

表1 原水水質指標

1.3 檢測項目及方法

1.3.1常規水質指標測定方法

常規水質指標測定方法見表2。

表2 常規檢測項目及其檢測方法

1.3.2高通量測序

將黏附在膜絲(C1)和懸浮填料(C2)表面的生物質用塑料刀片小心地刮下，從反應器底部剩余污泥排放口收集活性污泥樣本(C3)，穩定運行2個周期，運行結束時共收集到6個樣本，即C1-1、C1-2、C2-1、C2-2、C3-1和C3-2。送檢前將所有樣本保存在-20℃冰箱的無菌離心管中，送檢時將所有樣本置于含有足夠干冰的保溫箱中運送到微基生物科技(上海)有限公司(中國上海)，進行DNA提取和高通量測序。

采用二次擴增的方法提高目標DNA的純度，PCR擴增體系的參數見表3。第一次PCR擴增條件為94°C下預變性2 min；94°C下變性30 s，56°C下退火30 s，72°C下延伸30 s，總共23個擴增循環；最后72°C下延伸5 min，10°C保存。第二次PCR擴增條件為94°C下預變性2 min；94°C下變性30 s，56°C下退火30 s，72°C下延伸30 s，總共8個擴增循環；最后72°C下延伸5 min，10°C保存。根據試驗需求，設計引物如下。

F內側引物：5′-TTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-barcodeF1特異引物-3′；

F外側引物：5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-TCTTTCCCTACACGACGCTC-3′；

R內側引物：5′-GAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA- barcodeR1特異引物-3′；

在小組合作過程中，為了更大地發揮同學之間的合作效能，可采用下列競爭方法，如：表揚激勵法、小組得分制、評選最佳組員等，可采用激勵性語言，并把小組合作成果具體量化，進行評比、給予公布。

R外側引物：5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT- barcodeR2 -GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGA-3′。

2 結果與分析

2.1 系統處理效果分析

試驗中HMBR系統處理后出水的理化指標見表4。按照GB 8978—1996《污水綜合排放標準》、GB 18918—2002《城鎮污水處理廠污染物排放標準》，出水滿足污水綜合排放的二級標準。該工況下HMBR對于COD和NH3-N的平均去除率分別高達94.2%、98.0%，對于TP和TN平均去除率分別達到了76.3%、40.6%左右。而傳統MBR系統處理COD、NH3-N、TN和TP的最高去除率分別是90%、98%、50%、63%[9]，與傳統MBR系統相比，HMBR系統在較難處理的TN和TP上平均去除率分別提高了52.60%、55.17%。這可能歸因于本系統中生物膜內層形成的厭氧微環境使得反應器內部具有更多元化的環境，有利于各種類型微生物的代謝，特別是具有脫碳脫氮除磷功能的微生物，因此生物膜內層可以進行反硝化反應，故而脫氮效果較傳統活性污泥工藝有明顯提高。為了從生物學角度揭示HMBR去除污染機理，下面將從群落結構和功能菌的角度進行探討。

表4 HMBR工藝運行效果

2.2 微生物群落多樣性分析

2.2.1各樣本 Alpha 多樣性分析

圖2所示，6個樣本的稀釋性曲線皆趨于平緩，可見樣品的測序數據量趨于飽和，即樣本的測序深度已經能夠較為精準地反映出樣品中OTU的豐富程度。根據圖3中的Chao指數曲線和Ace指數曲線可見C3組的OTU總數最大，C2組次之，C3最小，而根據Shannon指數和Simpson指數可知三組的物種豐富度呈現出C2組>C3組>C1組。

圖2 稀釋性曲線

a) Simpson圖3 Alpha多樣性指數

b) Shannon指數曲線

c) Ace

d) Chao續圖3 Alpha多樣性指數

2.2.2樣本間Venn分析

Venn(花瓣)圖可用于統計多個樣品中所共有和獨有的OTU數目，可以比較直觀地表現環境樣品的OTU數目組成相似性及重疊情況。將C1、C2、C3 3個組別中的平行樣取平均值統計后得圖4、表5。3個組別中共有的OTU數目為1 034個，其中3個組別獨有的OTU數目分別為122個(C1)，235個(C2)以及252個(C3)，兩兩樣本之間分別有44個(C1∩C2)、439個(C2∩C3)和173個OTU(C1∩C3)。由此可見，C2、C3組的樣品微生物組成結構上更為接近。

圖4 C組Venn花瓣

表5 各組別OTU共有數目交集

2.2.3基于OTU的Beta 多樣性分析

通過對3組樣品的聚類分析以及差異性分析，圖5所示，3個組別因位置的區別在微生物進化方面存在明顯差異，而C1與C3在門水平下進化相似度較高。通過分析統計出相對豐度大于1%的菌屬，作為3組樣品中的優勢菌屬。其中，C1組別樣品中的優勢菌屬依次為：變形菌門(Proteobacteria，68.7%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，16.6%)、厚壁菌門(Firmicute，6.7%)和酸桿菌門(Actinobacteria，4.2%)；C2組別樣品中的優勢菌屬依次為：變形菌門(Proteobacteria，54.4%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，18.0%)、浮霉菌門(Planctomycetes，8.4%)和厚壁菌門(Firmicute，7.6%)，綠彎菌門(Chloroflexi，3.2%)和藍藻細菌門(Cyanobacteria，2.0%)， 酸桿菌門(Actinobacteria，1.9%)；C3組別樣品中的優勢菌屬依次為：變形菌門(Proteobacteria，63.4%)、厚壁菌門(Firmicute，12.1%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，7.7%)、酸桿菌門(Actinobacteria，5.6%)、浮霉菌門(Planctomycetes，3.7%)、綠彎菌門(Chloroflexi，2.9%)、藍藻細菌門(Cyanobacteria，1.1%)。

由圖5可知，Proteobacteria(變形菌門)是膜絲污泥、活性污泥和和懸浮填料中的絕對優勢菌群[10-11]。Proteobacteria為革蘭氏陰性菌，大部分Proteobacteria能夠以有機物作為碳源，代謝類型多種多樣，是典型的兼性異養菌，污水中的COD大部分由此類微生物降解[12]。由分析結果還可以得知在此HMBR工藝中，脫碳菌主要存在于膜絲表面和懸浮填料表面。相較于Proteobacteria(變形菌門)而言，Bacteroidetes(擬桿菌門)在系統中相對豐度較小，但仍然是優勢菌種，特別是在C1、C2中(相對豐度分別為16.6%、18.2%)。Bacteroidetes(擬桿菌門)是化能異養菌，能夠降解纖維素、淀粉、蛋白質、脂類等大分子有機物[13]。

圖5 門水平樣品聚類樹與柱狀圖組合分析

表6 HMBR(膜生物反應器)系統中硝化作用微生物分類統計

懸浮填料的投加增加了Proteobacteria(變形菌門)和Bacteroidetes(擬桿菌門)的數量，與傳統的MBR相比能夠提高污染物的去除率。

2.3 脫氮菌分析

此HMBR系統檢測到的兩大AOB優勢菌群，分別是Nitrosomonas(亞硝化單胞菌，50.9%)和未培養菌(49.1%)；在NOB克隆文庫中檢測到傳統的硝化菌屬——Nitrospira(硝化螺菌屬)，而沒有檢測到另一個傳統的硝化菌屬——Nitrosococcus(硝化桿菌屬)。進一步分析AOB和NOB在本反應器內分布的位置可知，AOB和NOB主要存在于懸浮填料表面，這是因為這兩類微生物的世代時間較長，而膜生物反應器中懸浮填料上的微生物生長在固定的載體上，其SRT和HRT可分別控制，因此有利于亞硝酸菌和硝酸菌的生長。通過分析Nitrosomonas和Nitrospira在不同污泥樣品中的相對豐度可知，硝化作用主要在活性污泥混合液和懸浮填料上進行，因此可以推斷HMBR中懸浮填料的投加能夠促進硝化作用。

生物脫氮的最后一個環節是反硝化，傳統的反硝化過程是由反硝化菌在缺氧或厭氧環境下將硝酸氮和亞硝酸氮還原成N2，能夠進行這類反應的細菌主要有Proteus(變形桿菌屬)、Micrococcus(微球菌屬)、Bacillus(芽胞桿菌屬)、Alcaligenes(產堿桿菌屬)、Flavobacterium(黃桿菌屬)等兼性細菌，在本HMBR系統中檢測到的有Micrococcus、Pseudomonas、Bacillus、Alcaligenes和Flavobacterium，其中Flavobacterium的相對豐度較高。除了厭氧反硝化菌外，在本系統的混合液和膜絲表面還檢測到好氧反硝化菌屬，比如從屬于β-Proteobacteria的Comamonas(叢毛單胞菌屬)和Pseudomonas(假單胞菌屬)，說明此反應器內存在同步硝化反硝化過程。

3 結論

本文研究了HMBR的污染物去除效果，從微生物學角度比較分析了HMBR內部各單元的群落結構差異，并探討了功能微生物脫氮菌在HMBR內的分布特點及原因，得到以下結論。

a) 本試驗測序數據量合理，可以反映樣品中的真實情況；各樣本差異明顯，膜絲和混合液中的微生物在門水平下發育關系更為接近；HMBR系統中的絕對優勢種群為變形菌門(Proteobacteria)，占克隆子總數的62.18%，其次是擬桿菌門(Bacteroidetes)，優勢菌群與常規活性污泥系統、脫氮系統、除磷系統的優勢菌群類似。

b) HMBR中含有豐富的脫氮菌，亞硝化和硝化過程主要由懸浮填料表面的AOB和NOB完成，反硝化反應主要發生在混合液和膜絲表面，這些微生物相互協作，共同完成整個系統的脫氮過程。

c) 懸浮填料的投加促進了厭氧環境的形成，多種代謝類型的微生物的大量存在表明系統內同時存在好氧反硝化、異養硝化和同步硝化反硝化等多種脫氮途徑，從而提高了脫氮效率。