支氣管哮喘患兒急性期血清miR-218、CCL26表達及臨床意義

肖雷 李蘭蘭 唐華 劉雅麗

支氣管哮喘是目前影響兒童健康最常見的慢性呼吸系統疾病，可發生于各年齡組，在全球范圍內發病率呈逐漸升高趨勢[1]。支氣管哮喘是一種由嗜酸性粒細胞、肥大細胞和T淋巴細胞等多種炎性細胞參與的慢性非特異性炎癥，以可逆性氣道阻塞、氣道高反應性和氣道炎癥為特征，臨床癥狀有反復發作的咳嗽、喘息、氣急以及胸悶等[2]。哮喘的發病因素及發生機制極其復雜，目前認為Th1型細胞與Th2型細胞之間數量和功能的失衡可能是哮喘發生的主要發病機制[3]。MicroRNA(miRNA)是一類非編碼小RNA，長度約22個核苷酸，通過與靶基因mRNA的3′-非編碼區(UTR)結合在轉錄后水平負向調控基因的表達。大量研究表明miR-218在多種腫瘤組織中異常表達，引起人們關注[4]。有研究發現，miR-218在肺癌組織中呈低表達，miR-218可能通過抑制Robo1的表達，抑制肺癌細胞侵襲遷移[5]。而多項研究表明miR-218在慢性阻塞性肺炎患者肺組織或循環體液中一致性下調，表明miR-218與呼吸道疾病相關[6]。嗜酸性粒細胞趨化因子3(eosinophil chemotactic factor-3,eotaxin-3)又稱CCL26，是CC型趨化因子中的一員，可被Th細胞分泌，是近年來發現的炎癥反應調控分子，在過敏反應及炎性反應中具有重要作用[7]。有研究表明，在慢性鼻竇炎患者黏膜組織中eotaxin-3呈高表達，能夠啟動炎癥因子的表達，誘導炎癥反應級聯放大[8]。miR-218與CCL26在兒童支氣管哮喘中的研究較少，本研究探究了miR-218與CCL26在支氣管哮喘急性期患兒血清中的表達及臨床意義。

資料與方法

一、一般資料

選取2018年6月至2019年6月本院收治的支氣管哮喘急性期患兒63例為觀察組，男37例，女26例，年齡2～12歲，平均年齡(5.68±3.96)歲；入院復查的哮喘緩解期患兒22例為對照組，男15例，女7例，年齡2～12歲，平均年齡(5.32±3.14)歲。根據《支氣管哮喘防治指南》[9]對哮喘急性期患兒病情嚴重程度進行分級，哮喘急性期輕度發作患兒25例為輕度組，中度發作患兒20例為中度組，重度發作患兒18例為重度組。觀察組與對照組患者年齡、性別等一般資料差異無統計學意義，具有可比性(兩組年齡比較t值為0.386、P值為0.701；兩組性別比較卡方值為0.613、P值為0.434)。納入標準：①所有患兒均符合中華醫學會呼吸病學分會哮喘學組2008年修訂的支氣管哮喘診治指南標準[9]；②年齡<14歲；③所有患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。排除標準：①過敏性疾病如系統性紅斑狼瘡等自身免疫系統疾病患兒；②近一個月內出現呼吸道感染者；③近三個月內應用糖皮質激素者。本研究經本院倫理委員會批準。

二、主要試劑與儀器

Trizol試劑(上海信帆生物科技有限公司，批號XF-P2960)、RNA逆轉錄試劑盒(K1622，Fermentas，MA，USA)、PCR試劑盒(Thermo Fisher)、引物(上海捷瑞公司合成)、人血清CCL26 酶聯免疫(ELISA)試劑盒(上海瓦蘭生物科技有限公司，貨號：WK-SU00052)、白細胞介素-13(IL-13)ELISA試劑盒(上海群己生物有限公司，貨號：KA3943)、IL-17、IgE ELISA試劑盒(上海歌凡生物科技有限公司，貨號：HI029、HI079)；-80℃超低溫冰箱(北京德馨永嘉科技有限公司)、實時熒光定量PCR儀(德國Roche公司，型號LightCycler 480 Ⅱ)。

三、研究方法

(1)樣本的采集與保存

所有受試者于住院第二日清晨抽取空腹靜脈血5 mL，以3 000 r/min離心15 min后分離血清，置于-80℃冰箱保存待測。

(2)qRT-PCR法檢測血清miR-218水平

用Trizol法提取血清中總RNA，嚴格按照逆轉錄試劑盒說明書操作，將RNA逆轉錄為cDNA，采用2×SYBR Green PCR Master Mix試劑盒，以cDNA為模板進行擴增。引物由上海捷瑞公司設計合成，引物序列(見表1)。反應條件：95℃預變性10 min，95℃變性10 s，63℃退火25 s，72℃延伸10 s，共進行42個循環。采用2-ΔΔCt法，以U6作為內參，計算miR-218相對表達量(見表1)。

表1 引物序列

(3)酶聯免疫吸附法檢測血清CCL26水平

采用上海瓦蘭生物科技有限公司生產的CCL26 ELISA試劑盒，嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行加樣、加酶標抗體、溫育、洗滌、顯色、終止，測定受試者血清中CCL26的濃度3次，取平均值。

(4)觀察指標

采用IL-10、IL-13、IL-17、IgE試劑盒，嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作，測定受試者血清中IL-10、IL-13、IL-17、IgE濃度。

采用肺功能檢測儀(德國JAEGER公司，型號：Master Scope Diffusion)對受試者肺功能進行檢測，得到1s用力呼氣量(FEV1)及呼氣峰流速(PEF)，指標以實測值占預計值百分比表示。

四、統計學分析方法

結 果

一、兩組患兒血清miR-218、CCL26表達水平比較

與對照組相比，觀察組患兒血清中miR-218水平顯著降低(P<0.05)；血清CCL26水平顯著升高(P<0.05)(見表2)。

表2 兩組miR-218、CCL26表達水平比較

二、兩組患兒血清中相關炎性因子水平比較

與對照組相比，觀察組患兒IL-13、IL-17、IgE表達顯著升高(P<0.05)；FEV1、PEF水平顯著降低(P<0.05)(見表3)。

表3 兩組患兒血清中相關炎性因子水平比較

三、不同嚴重程度患兒血清中miR-218、CCL26表達水平比較

與輕度組相比，中度組、重度組患兒血清miR-218水平顯著降低，CCL26水平顯著升高(P<0.05)；與中度組相比，重度組患兒血清miR-218水平顯著降低，CCL26水平顯著升高(P<0.05)(見表4)。

表4 不同嚴重程度患兒血清中miR-218、CCL26表達水平比較

四、血清miR-218、CCL26表達水平相關性分析

結果顯示，miR-218與CCL26、IL-13、IL-17、IgE呈負相關(r=-0.614、-0.610、-0.678、-0.498，P<0.05)，與FEV1、PEF呈正相關(r=0.680、0.643，P<0.05)；CCL26與FEV1、PEF呈負相關(r=-0.659、-0.714，P<0.05)，與IL-13、IL-17、IgE呈正相關(r=0.529、0.635、0.522，P<0.05)(見表5)。

表5 血清miR-218、CCL26水平與炎癥因子相關關系

討 論

支氣管哮喘是兒童時期最常見的慢性疾病，近年來，隨著環境污染日益嚴重，支氣管哮喘的患病率和死亡率快速增加[10]。目前對其發病機制尚未完全了解，可能的發病機制有免疫學機制、遺傳學和環境因素、神經受體調節機制、呼吸道感染等[11]。既往學者認為Th1/Th2細胞功能失調是支氣管哮喘的主要發病機制，免疫功能下降，外源性致敏原被抗原遞呈細胞吞噬并激活T細胞，產生大量炎性因子及多種活性物質，導致氣道平滑肌收縮劑，氣道壁細胞分泌物增多，引發臨床癥狀，免疫功能下降亦可活化輔助性Th2細胞，激活免疫細胞聚集，吞噬炎性細胞，同時釋放出多種炎性介質、細胞因子等[12]。

miR-218由miR-218-1和miR-218-2兩基因編碼，分別位于染色體4p15.2及5q34-35[13]。研究發現，miR-218靶基因主要富集在生物學調控、蛋白代謝、細胞遷移和黏附、細胞分化等生物學過程，以及蛋白結合、連接酶活性等分子功能中[14]。miR-218在子宮頸癌和頭頸部腫瘤中的研究結果顯示，腫瘤細胞轉染miR-218后LAMB3表達下降，通過siRNA抑制LAMB3表達，細胞的生長、侵襲轉移能力受到抑制[15]。有研究發現miR-218在急性淋巴白血病T淋巴細胞中表達下調，可通過負性調節KIT蛋白的表達，并抑制急性淋巴細胞白血病T淋巴細胞的細胞增殖，促進凋亡[16]。miR-218在支氣管哮喘中的研究較少，本實驗結果顯示，與支氣管哮喘緩解期患兒相比，急性期患兒血清中miR-218水平顯著降低，提示miR-218可能與支氣管哮喘急性期有關。且隨急性期患兒病情嚴重程度的增加，血清miR-218表達水平呈逐漸下降趨勢，提示血清miR-218與支氣管哮喘急性期發病的過程相關。

CCL26位于23染色體上的7q11.含有3個外顯子，由77個氨基酸構成，可與CCR3受體結合[17]。目前認為嗜酸性粒細胞(EOS)是哮喘氣道炎癥發生的主要效應細胞，而有研究表明，在體外CCL26對嗜酸性粒細胞具有趨化作用[18]。CC趨化因子不僅局部趨化作用，免疫調節、抗病毒免疫、調節細胞代謝，同時還能夠促進釋放組胺參與過敏反應[19]。已有研究表明，哮喘患者支氣管黏膜中CCL26表達明顯增高，而在患者血清中的表達少有研究。本研究結果顯示，CCL26在支氣管哮喘急性期患兒血清中呈高表達，提示CCL26與支氣管哮喘急性期的發病有關。且隨支氣管哮喘急性期患兒病情嚴重程度的增加，CCL26水平呈逐漸升高趨勢，提示血清CCL26與支氣管哮喘急性期的病情發展有關，能夠一定程度反應患兒病情嚴重程度。另對患兒血清中炎癥因子及肺功能進行檢測，IL-13、IL-17是細胞免疫中的重要細胞因子，IgE屬于IL13下游因子，屬于Th2型細胞因子，且與嗜酸性粒細胞浸潤關系密切；FEV1和PEF是評價支氣管哮喘嚴重程度和療效的重要指標，可以反映患者的氣流受限程度，支氣管哮喘發作時其水平降低，與支氣管哮喘嚴重程度具有良好的正相關性[20]。結果顯示，支氣管哮喘急性期患兒血清中炎性因子IL-13、IL-17、IgE呈高表達，肺功能FEV1、PEF顯著低于緩解期患兒。提示血清中炎性因子過表達與支氣管哮喘急性期發病有緊密聯系，急性期患兒炎癥反應顯著高于緩解期患兒；急性期患兒肺功能顯著下降，支氣管哮喘發作對患兒肺功能影響顯著。而相關性分析顯示，血清miR-218與CCL26、IL-13、IL-17、IgE呈負相關，與FEV1、PEF呈正相關；CCL26與FEV1、PEF呈負相關，與IL-13、IL-17、IgE呈正相關。提示血清miR-218可能通過介導炎性反應，影響支氣管哮喘患兒肺功能及病情嚴重程度；CCL26可能在嗜酸性粒細胞的黏附、募集和脫顆粒中發揮重要作用[21]。

綜上所述，在支氣管哮喘急性期患兒血清中miR-218呈低表達，CCL26、IL-13、IL-17、IgE呈高表達。支氣管哮喘急性期患兒FEV1、PEF水平顯著低于緩解期患兒。