miR-92b在非小細胞肺癌組織中的表達及臨床意義

張文靜 馬君 許弘邦

肺癌作為呼吸系統高發(fā)惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率均高居我國惡性腫瘤首位，且發(fā)病率呈不斷升高趨勢[1]，對人群生命安全構成嚴重威脅，已成為我國重要的公共衛(wèi)生問題。其中，非小細胞肺癌是最為常見的類型，約占肺癌的85%左右[2]，且該類型的肺癌早期缺乏典型癥狀，在我國有超過2/3的患者臨床確診時已無法進行手術治療[3]，患者總體預后較差，5年生存率較低[4]。因此，積極探討影響非小細胞肺癌患者預后的相關機制，尋找診療的敏感基因，對改善患者預后，提高生存率，具有重要意義。微小RNA(micro RNA，miRNA)作為廣泛存在于真核生物體內的高度保守的小分子非編碼RNA，可通過調控miRNA降解或抑制功能蛋白翻譯，而在細胞增殖、分化、生長、凋亡等生理過程中發(fā)揮重要作用，近年來研究發(fā)現[5]，其與惡性腫瘤發(fā)生、進展、侵襲、轉移過程密切相關[6]。miR-92b作為miRNA重要類型，已有研究表明其參與了惡性腫瘤發(fā)生及進展[7]。本研究分析了非小細胞肺癌組織中miR-92b表達，探討其與臨床病理指標相關性及對患者預后的影響。

資料與方法

一、臨床資料

選取2012年4月至2014年4月在山東省立第三醫(yī)院接受手術治療的非小細胞肺癌患者，納入標準：①均在術前完善相關檢查，具體手術適應癥，未接受任何治療，術后病理檢查確證是非小細胞肺癌；②臨床資料完整。共納入103例，男性62例，女性41例，年齡36～74歲，平均(58.82±8.6)歲，組織學類型：鱗癌41例，腺癌62例；腫瘤直徑：>3 cm 38例，≤3 cm 65例；TNM分期：Ⅰ期46例，Ⅱ期38例，Ⅲ期19例； 58例出現淋巴結轉移。留取非小細胞肺癌組織及距離腫瘤邊緣在5 cm以上的癌旁組織，保存于液氮中。本研究通過山東省立第三醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者均行知情同意。

二、方法

1 主要試劑和設備

Trizol總RNA提取試劑盒購自美國Invitrogen公司，反轉錄試劑和PCR擴增試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司，引物序列由上海權陽生物科技有限公司，StepOnePlus型實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

2 實驗方法 取組織，剪碎、研磨，細胞裂解液裂解，用總RNA提取試劑盒提取總RNA，并檢測其純度，合格標準：A260/A280位于1.80～2.20。使用反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA，條件：30℃ 10 min，95℃ 5 min。按PCR擴增試劑盒說明，以cDNA為模板，用實時熒光定量PCR儀對引物進行擴增，引物序列：miR-92b：上游：5′-AGGGACGGGACGCGGTGCAGTG-3′，下游：5′-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3′；U6：上游：5′-CTCGCTYCGGCAGCAC-3′，下游：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反應條件：94℃ 2 min，94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，循環(huán)38次。用2-ΔΔCt法計算非小細胞肺癌和癌旁組織中miR-92b表達量[8]。

3 病例隨訪 于術后第1 d起對患者進行隨訪，包括住院期間查房，以及出院后門診復診、電話、病歷追蹤等。截止日期2019年4月30日，患者死亡時終止隨訪，其余患者均隨訪滿5年(60個月)，記錄患者5年內發(fā)生死亡事件數及生存時間。

三、統計學方法

結 果

一、非小細胞肺癌和癌旁組織中miR-92b表達

miR-92b在非小細胞肺癌組織中表達量為(2.31±0.15)，而在癌旁組織中則為(1.01±0.10)，差異有統計學意義(t=85.839，P<0.001)。

二、不同臨床病理指標的非小細胞肺癌患者組織中miR-92b表達

miR-92b在不同年齡、性別、是否吸煙、不同組織學類型和腫瘤直徑的非小細胞肺癌患者組織中的表達量間差異無統計學意義(P>0.05)，與TNM分期Ⅰ期和未發(fā)生淋巴結轉移的患者相比，miR-92b在TNM分期Ⅱ～Ⅲ期和發(fā)生淋巴結轉移患者組織中表達量升高(P<0.05)(見表1)。

表1 不同臨床病理指標的非小細胞肺癌患者組織中miR-92b表達比較

三、非小細胞肺癌患者組織中miR-92b表達量與預后的相關性

103例非小細胞患者隨訪期間死亡71例，隨訪時間1～60個月，中位隨訪時間，以miR-92b在非小細胞肺癌患者組織中表達量的P25值為界值，患者分為低表達組(n=26)和高表達組(n=77)，生存分析結果顯示，低表達組5年累積生存率為57.69%，平均生存時間為(46.46±3.45)個月，高表達組分別為19.48%和(28.00±2.19)個月，差異有統計學意義(χ2=13.395，P<0.001)(見圖1)。

四、影響非小細胞肺癌患者預后的相關因素

變量賦值(見表2)。結果顯示，TNM分期、淋巴結轉移和miR-92b表達是影響非小細胞肺癌患者預后的風險因素(HR=2.409、3.055和2.069，P<0.05)(見表3)。

圖1 非小細胞肺癌患者組織中miR-92b表達對預后影響的Kaplan-Meier圖

表2 變量賦值

表3 影響非小細胞肺癌患者預后的多因素分析

討 論

近年來，雖然新的診療技術不斷應用于臨床，但由于多數非小細胞肺癌患者發(fā)現時已進展至中晚期，治療效果依然不佳，預后生存率較低[9]。因此，

積極尋找有助于非小細胞肺癌患者早期診療的分子學指標及治療靶點，對患者早期診斷及改善預后具有重要意義。隨著研究深入，miRNA在惡性腫瘤發(fā)生、進展、侵襲和轉移中的作用越來越被重視[10]。有研究指出[11]，非小細胞肺癌患者組織中存在miRNA表達譜異常。miR-92b是miR-106a-363基因簇成員之一，有研究指出[12]，其在食管鱗狀細胞癌組織中表達異常，且與病理分級強烈相關。王宇等[13]指出，神經膠質瘤組織中miR-92b表達量顯著增加，且與腫瘤細胞生物學功能有關。Wu等[14]研究發(fā)現，miR-92b失調與骨肉瘤有關，在骨肉瘤組織中表達上調，且與晚期肺轉移和淋巴結轉移有關。本研究結果顯示，miR-92b在非小細胞肺癌組織中的表達量高于癌旁組織，說明miR-92b在非小細胞肺癌組織中呈高表達。本研究結果顯示，與TNM分期Ⅰ期和未發(fā)生淋巴結轉移的患者相比，miR-92b在TNM分期Ⅱ～Ⅲ期和淋巴結轉移的組織中表達量明顯升高，說明miR-92b表達可能與惡性進展的臨床病理指標有關。

Zhou等[15]指出，miR-92b高表達與膽管癌患者不良結局有關。Wang等[16]研究指出，miR-92b過表達與肝細胞癌預后較差有關。本研究結果顯示，低表達組患者5年累積生存率和平均生存時間均高于高表達組，說明miR-92b表達量與非小細胞肺癌患者預后有關，miR-92b高表達可影響患者5年累積生存率及生存時間。多因素分析結果進一步說明miR-92b高表達是影響非小細胞肺癌患者預后的風險因素，提示miR-92b可能是評估非小細胞肺癌預后的潛在生物學標志物，但miR-92b具體是如何參與非小細胞肺癌發(fā)生、進展過程，以及如何對患者生存時間產生影響，尚需進一步開展相關實驗研究予以明確。

綜上所述，miR-92b在非小細胞肺癌組織中表達量升高，且與不良預后有關，是影響預后的獨立風險指標，有望成為患者預后評估的潛在標志物，但具體機制有待開展相關的實驗研究進行驗證。