普樂沙福的波譜學特征和結構確證

江任之，梁平，王玲，程紅，曾甜甜，嚴定策（華中科技大學分析測試中心，武漢 430074）

普樂沙福（plerixafor）是一種趨化因子受體4（CXCR4）特異性拮抗劑。由美國健贊公司（Genzyme Corporation）研發，2008年12月 經美國食品藥品監督管理局（FDA）批準上市，商品名稱為Mozobil。2010年7月，通過國家食品藥品監督管理局批準，在國內上市[1-4]。該藥物能阻斷CXCR4 與其同源配體基質細胞衍生因子-1α（SDF-1α）的結合和相互作用，并阻止造血干細胞進入骨髓。普樂沙福屬于造血干細胞動員藥，調動干細胞從骨髓進入血液循環，用于多發性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤等成年腫瘤患者的自體干細胞移植[5-6]。普樂沙福是一種白色或類白色粉末，其化學名稱為1，1'-[1，4-亞苯基（亞甲基）]-二-1，4，8，11-四氮雜環十四烷，分子式：C28H54N8，相對分子質量：502.78，化學結構式見圖1。由于屬于罕用藥物，普樂沙福的相關研究主要集中在合成工藝改進[2，4，7-10]、合成中有關物質液相色譜分析方法建立[11]、藥物的藥理作用和臨床評價[5-6，12-13]等領域。目前，其全面完整的波譜學特征尚未見文獻報道。本文采用紫外吸收光譜（UV）、紅外吸收光譜（IR）、質譜（MS）、核磁共振（NMR）等分析測試技術，依據《中國藥典》2015年版的規定要求，對普樂沙福樣品進行全面完整的波譜學表征和結構確證[14]，為普樂沙福的質量控制提供較全面的參考依據，也為各種波譜學方法在結構鑒定中的應用提供實例[15-16]。

圖1 普樂沙福的化學結構式Fig 1 Chemical structure of plerixafor

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Lambda35 型紫外分光光度計（美國PerkinElmer 公司）；Vertex 70 型傅立葉變換紅外光譜儀（德國Bruker 公司）；AscendTM600M 超導核磁共振儀（瑞士Bruker 公司）；LC/MS TRAPXCT 液質聯用儀（美國Agilent 公司）；Pyris1 TGA 熱重分析儀（美國PerkinElmer 公司）；DSC差示掃描量熱儀（Diamond）；Empyrean X 射線衍射儀（荷蘭PANalytical B.V.公司）。

1.2 試藥

普樂沙福（上海邁瑞爾化學技術有限公司，批號：M02028，HPLC 分析純度＞99%，符合藥物結構鑒定的需要）；氘代甲醇（MeOD，美國劍橋同位素實驗室公司）；甲醇（色譜純，德國默克公司）；其他試劑均為分析純；實驗用水為超純水（電阻率為18 MΩ·cm）。

2 結果與討論

2.1 紫外吸收光譜（UV）

將適量樣品分別溶于水、0.1 mol·L－1HCl溶液、0.1 mol·L－1NaOH 溶液中，適當稀釋，測定其紫外吸收光譜，如圖2所示。當溶于水中時（見圖2A），樣品在220、260 nm 附近有吸收峰；當溶于0.1 mol·L－1HCl 溶液中時（見圖2B），樣品于218、266、272 nm 附近有吸收峰；當溶于0.1 mol·L－1NaOH 溶液中時（見圖2C），樣品在219、263 nm 附近有吸收峰。說明樣品含有共軛結構，與普樂沙福化學結構吻合。

圖2 普樂沙福溶于水（A），0.1 mol·L－1 HCl 溶液（B）及0.1 mol·L－1 NaOH 溶液中的紫外吸收光譜（C）Fig 2 UV spectra of plerixafor solved in water（A），0.1 mol·L－ 1 HCl solution（B），and 0.1 mol·L－1 NaOH solution（C）

2.2 紅外光譜（IR）

以溴化鉀為參比，壓片法得到普樂沙福樣片的紅外光譜圖見圖3。根據譜圖所得紅外吸收峰數據進行解析，具體情況見表1。結果表明，普樂沙福含有大環烷、亞甲基、脂肪族仲胺、脂肪族叔胺、1，4-二取代苯環等結構。

2.3 核磁共振譜（NMR）

圖3 普樂沙福的紅外光譜圖Fig 3 IR spectrum of plerixafor

表1 普樂沙福紅外光譜數據與解析Tab 1 IR data and analysis of plerixafor

普樂沙福樣品的1H-NMR 圖譜見圖4，DEPT 135圖譜見圖5，1H-1H COSY 圖譜見圖6，13C-1H HMBC圖譜見圖7，13C-1H HSQC 圖譜見圖8，13C-NMR 圖譜見圖9。其中δH3.30 ppm 和δC47.70 ppm 為MeOD中的溶劑峰；δH4.80 ppm 為溶劑中水峰信號。因溶劑中含有少量水，故未觀察到活潑H 的信號。

2.3.11H 核磁共振譜（1H-NMR） H 譜中，由于環空間構型的影響，環上的CH2上的2 個H 不等價，造成高場區H 譜譜峰重疊嚴重。

由δH7.321 ppm 化學位移在低場，分析為對苯取代上CH，由HMBC 可知，δH7.321 ppm 與δC137.15 ppm 和δC57.15 ppm 相關，則δC137.15 ppm為C1，C4；δC57.15 ppm 為C11'，結 合HSQC 可知，δH3.583 ppm 為H11'，在HMBC 中，H11'和H11''與δC54.08 ppm 相關，故δC54.08 ppm 為C1'，則δH2.625 ～2.608 ppm 中有H1'。

2.3.213C 核磁共振譜（13C-NMR） 從C 譜、DEPT 135 和DEPT 90 可知，樣品中含有11 種仲碳、1 種叔碳、1 種季碳，結合樣品的對稱性可知，樣品中有22 個仲碳、4 個叔碳、2 個季碳。

從化學位移可知，δC137.15 ppm 低場，為對苯取代是季碳，δC129.09 ppm 則為對苯取代上的叔碳。化學位移在δC40 ～60 ppm 的則為與N 雜原子相鄰的CH2，化學位移在20 ～30 ppm 的多為C 鏈上的CH2。

由HSQC 可知，δC25.29 ppm 對應的是δH1.873ppm；δC27.93 ppm 對應的是δH1.651 ppm；在HMBC中，δH1.873 ppm 分別與δC50.55 ppm 和δC49.56 ppm相關，δH1.651 ppm分別與δC49.16 ppm 和δC53.91 ppm 相關，由此可知存在片段：N-δC50.55-δC25.29-δC49.56-N 和N-δC49.16-δC27.93-δC53.91-N，即C3'-C4'-C5'和C8'-C9'-C10'。

表2 普樂沙福樣品的NMR 數據及解析Tab 2 NMR data and analysis of plerixafor

2.4 高分辨率質譜（MS）

圖4 普樂沙福的1H-NMR 圖譜Fig 4 1H-NMR spectrum of plerixafor

圖5 普樂沙福的DEPT 135 圖譜Fig 5 DEPT 135 spectrum of plerixafor

圖6 普樂沙福的1H-1H COSY 圖譜Fig 6 1H-1H COSY spectrum of plerixafor

圖7 普樂沙福的13C-1H HMBC 圖譜Fig 7 13C-1H HMBC spectrum of plerixafor

圖8 普樂沙福的13C-1H HSQC 圖譜Fig 8 13C-1H HSQC spectrum of plerixafor

圖9 普樂沙福的13C-NMR 圖譜Fig 9 13C-NMR spectrum of plerixafor

取適量樣品，用甲醇溶解并經0.22 μm 的兩相膜過濾后直接進樣，采用APCI 正模式，進行質譜分析。普樂沙福樣品的一級、二級質譜圖見圖10。在一級質譜圖（圖10A）中可見準分子[M＋H]＋（A）離子峰，分子量為503。經軟件模擬，推測m/z503.2 的分子式為C28H54N8。

由m/z503.2 的二級質譜推測，A 失去NH3得到碎片B，分子量為486；B 失去C2H2得到碎片C，分子量為460；C 失去CH2得到碎片D，分子量為446；D 失去NH3得到碎片E，分子量為429；E 失去C2H2得到碎片F，分子量為403；F再失去C2H2得到碎片G，分子量為377；G 失去NH3得到碎片H，分子量為360；H 失去CH2得到碎片I，分子量為346；I 失去CH2CHNH2得到碎片J，分子量為303；J 失去C8H9N 得到碎片K，分子量為184；K 失去CH2CHNH2得到碎片L，分子量為141。質譜解析結果如圖11所示。

圖10 普樂沙福的一級質譜圖（A）和二級質譜圖（B）Fig 10 MS spectrum（A）and MS characteristic spectrum（B）of plerixafor

通過元素分析儀測試，樣品中C、H 和N元素的質量百分比分別為66.79%、10.960%和22.26%，推測樣品中C∶H∶N 原子個數比為14∶27∶4。說明質譜結果與元素分析結果一致，由此可以確定所測樣品的分子式為C28H54N8，與普樂沙福的分子式相同。

2.5 熱分析與X-射線衍射

稱量適量樣品，用高純氮氣作為保護氣，氣流速度，從30℃升溫至800℃，升溫速度5℃·min－1，測得樣品的熱重分析（TGA）曲線。差熱分析（DSC）的測試條件為：在20 mL·min－1的氮氣保護下，以空鋁坩堝為參比，取樣品適量于鋁皿中稱重壓片后從100℃以5℃·min－1升溫到160℃。由樣品的TGA 圖（見圖12）可知，樣品在30 ～800℃總失重率為99.7%，樣品溫度升高到220℃后逐漸分解揮發；由DSC 圖可見一個向上的吸熱峰，熔融起始溫度131.2℃，頂點溫度133.9℃，終止溫度134.8℃，熔融熱焓164.5 J·g－1，推測為樣品熔融峰，與文獻報道的普樂沙福的熔點比較接近[2]（見圖13）。

圖11 普樂沙福的質譜解析圖Fig 11 Analysis result of MS spectrum of plerixafor

表3 普樂沙福樣品X-射線粉末衍射數據Tab 3 X-ray powder diffraction data of plerixafor

圖12 普樂沙福的熱重分析圖Fig 12 TGA curve of plerixafor

圖13 普樂沙福的差熱分析圖Fig 13 DSC curve of plerixafor

取適量樣品于玻璃凹槽中壓平，在2θ＝3°～60°內掃描得到X 射線衍射圖譜，衍射峰的相關數據見表3，可知樣品呈多晶態。

3 結論

通過UV、IR、MS 以及NMR 一維及二維譜測試技術，獲得了目標化合物的波譜學數據，經分析目標化合物的分子結構與普樂沙福一致。并且通過元素分析、熱分析、X-射線粉末衍射等測試技術進行佐證。測試方法符合《中國藥典》要求，各圖譜歸屬合理，數據保持高度的一致性，最終準確確證普樂沙福的結構。以上波譜學特征分析不僅能夠準確說明普樂沙福的結構，也為該藥物定性研究和生產質量控制提供了分析和客觀的參考依據。