基于高通量測序重茬草莓土壤細菌和真菌多樣性分析

肖蓉 張春芬 鄧舒

摘?要：研究利用Illumina Miseq高通量測序技術，比較新茬草莓和連作3年草莓根際土壤細菌、真菌群落多樣性，旨在了解其微生物群落生態特征，為防治連作障礙奠定基礎。結果：重茬3年后土壤中細菌物種多樣性及豐富度降低;新茬土壤中豐度最高的鞘氨醇單胞菌被節桿菌屬取代，腸桿菌屬豐度顯著升高。對于真菌來講，重茬3年后土壤中真菌物種多樣性和豐富度增大;新茬土壤中含有植物病原菌鏈格孢菌和莖點霉菌，重茬3年后枝頂孢屬、被孢霉屬、鐮刀菌屬等病原菌大量積累。結論：重茬土壤中細菌多樣性降低、真菌多樣性增高，病原真菌積累是引起草莓連作障礙的主要原因。

關鍵詞：重茬;高通量測序;多樣性分析;草莓

文章編號：2096-8108（2021）01-0028-06?中圖分類號：S668.4?文獻標識碼：A

Abstract：In order to understand the ecological characteristics of rhizosphere soil microbial communities for strawberrys continuous obstacle controlling， the diversity of bacteria and fungi communities of newly cropped strawberry and continuously cropped strawberry for 3 years by high-throughput sequencing were compared. The results showed that the diversity and richness of bacterial in the soil decreased after continuous cropping. Sphingomonas with the highest abundance in new soil was replaced by Arthrobacter， and Enterobacter abundance increased significantly. For fungi， the diversity and richness increased after continuous cropping. There were Alternaria and Phoma in the new soil. But after 3 years of continuous cropping， a large number of other phytopathogens were accumulated such as Acremonium， Mortierella and Fusarium. In conclusion， the decrease of bacterial diversity， the increase of fungal diversity and the accumulation of pathogenic fungi in the soil were the main causes of strawberry continuous cropping obstacles.

Keywords：continuous cropping;high-throughput sequencing;diversity analysis;strawberry

生產中大棚草莓種植每年都要換新苗，因此重茬在所難免。連作障害是制約草莓發展的最大因素，據調查，連作4年草莓能減產40%以上[1]。目前，大家公認的連作障害的形成機理主要包括連作土壤中病原微生物積累[2]、土壤營養元素失衡[3]、化感作用[4-6]3個方面。而土壤微生態失衡是研究者所公認的連作障害發生的根本。其中微生物因素在整個連作障礙發生發展過程中一直扮演著關鍵角色。

在土壤這個黑匣子中到底有多少微生物，以及他們之間的結構信息、群體相互作用、與植物重茬障礙之間的關系等等吸引著人們持續而深入的研究。由于目前土壤中可培養的微生物僅占土壤微生物總數的1%左右，因此依賴于平板培養技術來研究土壤微生物生態顯然是不夠的[7]。近些年來，隨著現代生物技術和基因組學的蓬勃發展，以土壤中全部微生物基因組DNA序列為依據的微生物分子生態學研究方法正日益成為大家普遍接受的方法[8]。

本研究以同一個農業園區新茬草莓大棚和連作3年的重茬草莓大棚土壤為研究對象，直接提取草莓根際土壤總DNA，通過Illumina Miseq測序平臺對新茬土壤及重茬土壤細菌和真菌結構及功能多樣性進行比較分析，旨在找到重茬土壤中的優勢細菌和真菌類群，從微生物生態學角度研究草莓重茬障害發作時的生物學病因，為草莓重茬障礙防治提供理論依據。

1?材料與方法

1.1?供試土樣

土壤樣品采自山西省太原市陽曲縣同一個農業園區新茬草莓大棚和連作3年的重茬草莓大棚，于6月草莓剛收獲結束后采樣。每個大棚內按“S”形于大棚中間隨機挑選草莓植株4株，整株挖出置于冰盒中用無菌袋帶回實驗室，抖掉根部多余的土后用無菌毛刷刷取根際土，4個土樣混合成1個樣置于無菌離心管中，新茬土壤樣品命名為XJS1，重茬土壤樣品命名為CJS1。各類型選取4座大棚為采樣地，共獲得XJS1和CJS1樣本各4個，視為4次重復。

1.2?土壤微生物總DNA提取及測序

土壤微生物總DNA提取方法參考本課題組前期方法[9]。用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性后用Nanodrop 2000分光光度計測定其濃度，DNA合格樣品送生工生物工程（上海）股份有限公司完成后續多樣性測序工作。細菌多樣性測序選取V3-V4區作為靶向擴增區域，真菌多樣性測序選取ITS1-ITS2區作為靶向擴增區域。

3?結論與討論

本研究結果表明，重茬3年后土壤中細菌數量減少、真菌數量上升，這與前人的研究結果相似。甄文超等研究指出，連續種植草莓的農田土壤微生態環境有利于真菌的增殖而不利于細菌和放線菌，草莓根際和根表微生物真菌種群數量上升、細菌和放線菌的增殖減少，最終導致連作障礙發生[10]。薛超指出重茬土壤微生物從細菌主導型向真菌主導型轉化[11]。

本研究結果表明，重茬3年后，新茬土壤中豐度最高的鞘氨醇單胞菌被節桿菌屬取代，腸桿菌屬豐度顯著升高。王志剛從植物根際獲得一株鞘氨醇單胞菌，能高效解磷和分泌IAA，促進連作西瓜生長[12]。另外，很多文獻都指出鞘氨醇單胞菌和節桿菌與多環芳烴、苯酚、菲等芳香族污染物的降解有關[13-15]。而腸桿菌具有緩解鎘-砷富集對植物的脅迫[16]、降解植物的次生代謝產物縮合單寧（原花青素）[17]、降解除草劑阿特拉津的功能[18， 19]。因此，這可能暗示該園區土壤中有有機物污染。

本研究發現，重茬3年后的土壤真菌優勢菌與新茬土壤大相徑庭。原來在新茬土壤中占優勢的真菌豐度值大幅下降，而新崛起的豐度值增高的真菌大多與植物病害發生相關。比如重茬土壤中占優勢的絲核菌能引起多種植物（包括草莓）的黑根病、立枯病、葉腐病、莖腐等病害，是植物真菌病害防治的主要對象，也是草莓產區普遍發生的病害之一[20];輪枝菌屬導致黃萎病[21];鐮刀菌屬可危害多種植物，破壞植物的維管束系統，引起植物萎蔫死亡和器官腐爛，是生產上防治最艱難的土傳病害之一，在草莓上可引起枯萎病[22]。另一類占據優勢地位的菌是營腐生生活的菌屬，比如青霉菌和接合菌，這類菌常生長在腐爛的蔬菜、水果、肉類和各種潮濕的有機物上。由此可以推測：重茬3年的草莓地土壤中積累了相當數量的植物病原菌，殘枝敗葉的積累養育著一批腐生菌，土壤真菌環境不容樂觀。另外，值得注意的是，該園區新茬土壤中檢測到優勢菌鏈格孢菌和莖點霉屬細菌，鏈格孢菌能夠引起植物黑斑病、腐爛病等，也能引起草莓采后黑腐病[23];莖點霉菌寄主廣泛，能夠引起多種植物葉斑病、莖枯病等，其中部分種是檢疫性植物病原菌[24]，提示該地塊雖然是第1年栽種草莓，但前茬作物留下的病原菌也不容忽視。

綜上所述，對于細菌來講，重茬3年后土壤中細菌物種多樣性及豐富度降低;變形菌門和擬桿菌門是兩種生境中的優勢細菌;在屬水平上，新茬土中，豐度最高的前3位是鞘氨醇單胞菌、根瘤菌和假單胞菌，而在重茬土中，豐度最高的前3位是節桿菌、Olivibacter和根瘤菌;與新茬土相比，重茬土中鞘氨醇單胞菌、地桿菌和Skermanella豐度顯著降低，而節桿菌和腸桿菌豐度顯著升高。對于真菌來講，重茬3年后土壤中真菌物種多樣性增大;在門水平上，子囊菌門為兩種生境中的第一優勢菌;接合菌門在新茬土壤中含量很低，但重茬3年后的土壤中該菌豐度快速增長;在屬水平上，新茬土壤中含有植物病原菌鏈格孢菌和莖點霉菌，重茬3年后枝頂孢屬、被孢霉屬、鐮刀菌屬等病原菌大量積累。因此，重茬土壤中細菌多樣性降低、真菌多樣性增高，病原真菌積累是引起草莓連作障礙的主要原因。

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