響應面法優化鐵皮石斛花總黃酮的提取工藝

陳潤澤

（浙江農林大學 林業與生物技術學院，浙江 臨安 311300）

1 材料與儀器

鐵皮石斛花于2019年6月采摘于浙江省臨安市天目山鎮橫塘村麻泥角弄智能溫棚（N 119°26′11″，E 30°20′30″，海拔280 m），經浙江農林大學斯金平教授鑒定為蘭科石斛屬植物鐵皮石斛盛開的鮮花。鮮花經90℃下殺青，60℃下烘干后備用。蘆丁標準品，純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇，均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；實驗用水均為去離子水（實驗室自制）。

酶標儀，美國MD公司；電子分析天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；恒溫電熱鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；高速離心機，德國Heraeus公司。

2 試驗方法

2.1 鐵皮石斛花總黃酮的提取流程

取少量烘干備用的鐵皮石斛花磨粉，按物料比溶于不同濃度的乙醇溶劑中，在超聲波儀中提取一段時間后低溫離心，取上清液過膜，即制得鐵皮石斛花總黃酮提取液。

2.2 蘆丁標準曲線的制作

配置濃度為0.8 mg·mL-1的蘆丁對照品溶液，精密吸取 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、2.0 mL 蘆丁對照品溶液于25 mL容量瓶中，加80%的乙醇溶液補足至2 mL。依次加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min；加入10%硝酸鋁溶液1 mL搖勻放置6 min，再加入4%氫氧化鈉溶液10 mL，用80%乙醇定容至25 mL，搖勻放置15 min后在酶標儀510 nm波長處測定吸光度并繪制標準曲線（縱坐標為吸光度A，橫坐標為蘆丁質量濃度C）。

2.3 總黃酮含量的測定

取0.500 0（±0.003）g鐵皮石斛花置于50 mL離心管中，按照物料比加入一定體積的乙醇溶劑，超聲一段時間后冷卻至常溫經4 000 rpm，離心10 min，取上清液過膜得樣品溶液。取2 mL所得溶液采用2.2中的方法測定含量。

式中：C為顯色液中總黃酮的質量濃度（mg·mL-1）；V為顯色液的體積（mL）；M為樣品的質量（g）；N為稀釋倍數。

2.4 單因素試驗

乙醇提取濃度：按照 20∶1 的物料比（mL·g-1），超聲溫度40℃，超聲時間30 min，考察不同乙醇提取濃度（50%、60%、70%、80%、90%）對總黃酮得率的影響。

物料比：乙醇提取濃度為70%，超聲溫度40℃，超聲時間 30 min，考察不同物料比（30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1 mL·g-1）對總黃酮得率的影響。

超聲時間：乙醇提取濃度為70%、物料比（mL·g-1）為50∶1，超聲溫度40℃，超聲時間30 min，考察不同超聲時間（20、30、40、50、60 min）對總黃酮得率的影響。

2.5 響應面法優化

根據Box-Benhnkende的中心組合設計原理，以單因素試驗的結果為依據，以乙醇濃度（A）、物料比（B）、超聲時間（C）作為考察因子，以鐵皮石斛花總黃酮得率（Y）作為試驗指標，進行響應面回歸模型設計，因素及水平編碼見表1。

表1 Box-Behnken實驗設計因素與水平值

3 結果與分析

3.1 標準曲線及單因素試驗結果

蘆丁標準曲線和單因素對鐵皮石斛花總黃酮提取率的影響見圖1。本試驗的標準曲線為Y=0.5202X-0.0064，相關系數R2=0.999 7，X為蘆丁質量濃度，Y為吸光度，n=6。可見蘆丁標準曲線具有良好的線性關系，可用于計算鐵皮石斛花總黃酮的含量。鐵皮石斛花總黃酮提取率隨著乙醇濃度的增加出現先升高再下降的趨勢，故最佳乙醇濃度為70%；隨著物料比的增加，總黃酮提取率先上升再下降，物料比 1∶50（mL·g-1）最佳；總黃酮提取率含量隨著超聲提取時間的增加而增加，超聲時間超過30 min后總黃酮含量反而降低，故選用30 min為宜。

圖1 蘆丁標準曲線及單因素試驗結果

3.2 響應面試驗結果與回歸模型方差分析

響應面回歸模型試驗結果和方差分析結果見表2和表3。通過Design-Expert軟件回歸擬合上述實驗結果，得到下方實際因素回歸方程：

表2 Box-Behnken響應面試驗設計及結果

表3 Box-Behnken回歸模型的方差分析

Y=-49.01526+2.17992A+0.610074B+0.177693C-0.003158AB+0.000054BC+0.005726BC-0.014306A2-0.005659B2-0.006764C2。其中，響應值Y為鐵皮石斛花總黃酮的得率。

根據表3方差分析的結果可知，該模型的P值小于0.01，即回歸模型與實際測量值擬合程度很高。顯著性因素包括BC、A2、B2、C2（P＜0.05），而A、B、C、AB、AC不顯著因素（P＞0.05）。如表3所示，失擬項表現為不顯著（P值為0.276 5），說明回歸模型與實際測量值能較好地擬合。各因素的F值大小可以反映試驗因素對鐵皮石斛花黃酮得率的影響，F值越大，說明其對總黃酮得率的影響越大。由表 3 可知，F（A）=0.53，F（B）=0.03，F（C）=4.71，且 F（C）＞F（A）＞F（B），即各因素對鐵皮石斛花黃酮苷類成分得率的影響順序為超聲時間＞乙醇濃度＞物料比。

3.3 響應面各因素交互作用

三維空間響應面如圖2所示，如果響應值對系數的變化更敏感，則表面性能將更陡峭。如果響應值對系數的變化不敏感，則曲面性能將更平滑。從圖中可知，超聲時間對總黃酮得率的影響最大，超聲時間的改變會對鐵皮石斛花總黃酮得率造成極大影響，物料比和超聲時間的交互作用則影響相對較小。

圖2 各因素交互作用對總黃酮得率的影響

3.4 響應面模型驗證

采用響應面優化的最佳工藝參數為：乙醇提取濃度為 70.63%，物料比為52.46∶1（mL·g-1），超聲時間34.68 min，理論提取率為18.77 mg·g-1。考慮到實際提取情況，將提取條件設置為：乙醇提取濃度為70%，物料比為 52∶1（mL·g-1），超聲時間 34 min。在此條件下，鐵皮石斛花總黃酮的得率為19.50 mg·g-1，與預測結果相符，說明該模型較好的預測鐵皮石斛花總黃酮的提取率，優化工藝可靠。

4 結論

本研究采用響應面法對鐵皮石斛花超聲輔助提取總黃酮工藝進行優化，得到最佳的提取工藝條件為：乙醇提取濃度為 70%，物料比為 52∶1（mL·g-1），超聲時間34 min，在此條件下鐵皮石斛花總黃酮的提取率為3.9%。與已報道的單因素優化工藝（總黃酮提取率1.99%）相比，響應面法優化后總黃酮提取效果更好。該研究結果為鐵皮石斛花的資源開發利用提供了一定的理論基礎。