多糖的化學修飾及其結構鑒定研究進展

謝 苗，亓小妮，吳楊洋，張 鑫，杜秀菊

（聊城大學生命科學學院，山東 聊城 252059）

多糖是自然界中含量最多的一類高分子聚合物，具有抗腫瘤、抗病毒、免疫調節活性等生物活性［1］，是開發藥品和功能性食品的重要原料。然而，來自于天然產物的一些多糖本身不具有生物活性或活性很低，或者是因為溶解性很低而影響其活性發揮。例如，茯苓多糖幾乎不具有抗癌活性，但是經過羧甲基化等修飾后，在體內和體外都能表現出顯著的抗腫瘤活性［2］，硫酸化后的牛樟菇多糖的抗腫瘤活性有顯著提高［3］。

多糖及其衍生物的結構與生物活性有著非常密切的關系。多糖的化學修飾主要通過改變多糖的取代基種類、數目和位置、分子量、空間結構等從而影響其活性。研究表明，在多糖分子中引入合適的離子基團能夠顯著改善多糖的水溶性，通過改變多糖在水溶液中的構象提高其活性［4，5］。而且，不同的取代基團、取代位置和取代度（DS）對多糖衍生物的活性有著重要影響［6，7］。目前，多糖化學修飾的方法主要包括硫酸化、去硫酸化、磷酸化、乙酰化、去乙酰化、羧甲基化、硒化和降解等。

多糖衍生化前后的結構變化會在一些圖譜如紅外（Fourier transform infrared，FT-IR）圖譜和核磁共振（Nuclear magnetic resonance，NMR）圖譜上出現某些變化或產生一些特殊信號，通過比較修飾前后的圖譜變化，可以反映多糖衍生化發生成功與否以及取代度高低，進而闡明衍生物的化學結構，再結合生物活性，有助于揭示和闡明多糖的構效關系。本研究根據最新文獻資料，對多糖的化學修飾方法、衍生化多糖前后FT-IR 和NMR 圖譜特征的變化進行了綜述，以期對相關研究提供一些借鑒和參考。

1 多糖的化學修飾方法

多糖的主要化學修飾方法總結見表1，包括修飾類型、具體方法、所用試劑和生物活性等。

1.1 硫酸化修飾

硫酸化多糖參與很多生命過程，如生長分化、器官發生、病毒感染、血液凝聚和血管生成等［38］，在生命活動中起著非常重要的作用，因此，硫酸化修飾是多糖分子改性中非常重要的一個研究方向。研究表明，硫酸酯化多糖不僅增強原多糖的生物活性或產生新的藥理作用活性，還能改善原多糖的水溶性［8-13］。多糖的硫酸酯化方法很多，目前常用的方法主要有三氧化硫法、氯磺酸法（Wolfrom）和濃硫酸法。

Zhang 等［8］采用三氧化硫法對乳桿菌多糖進行硫酸化修飾，具體過程如下：取植物乳桿菌多糖樣品溶于無水二甲基甲酰胺（DMF）中，攪拌均勻后加入適量三氧化硫吡啶化合物即得到衍生化多糖。張忠等［39］采用氯磺酸法制備硫酸化金耳多糖。用不同的親核試劑溶解樣品，60 ℃保溫0.5 h，緩加氯磺酸反應3 h，冷卻至室溫，調節pH，透析，冷凍干燥獲得硫酸化后的金耳多糖。結果表明，DMF 為最佳溶劑（DS 最高，為1.43），硫酸化金耳多糖的抗氧化能力及抑瘤活性與DS 成正相關。

三種修飾方法各有優劣。三氧化硫法的缺點為三氧化硫類藥品價格昂貴，不利于大規模生產。濃硫酸法與氯磺酸法類似，均由濃硫酸提供硫酸基團，吡啶作為催化劑［40］。但多糖易被濃硫酸降解，所以濃硫酸法制備的多糖衍生化產品的得率和取代度往往最低。相比之下，氯磺酸法最優，目前廣泛用于吡喃型多糖的硫酸化，該方法簡單、有效，可在實驗室中進行。

1.2 去硫酸化修飾

硫酸基是天然復雜多糖（如肝素、某些海藻多糖等）的重要修飾成分，硫酸化多糖是目前研究最為集中的一個多糖。為了探討硫酸基團DS 和取代位置與多糖之間的構效關系，去硫酸化修飾是化學修飾研究的一個方向。目前有堿水解、酸水解和甲醇解3 種方法。其中，堿水解法硫酸基的去除率較低，酸水解法中硫酸基的去除率雖然較高，但在酸性條件下S-O 容易發生斷裂，采用甲醇解糖苷鍵則不受影響［38］。Xu 等［14］通過甲醇解的方法制得脫硫硫酸化的卡拉膠寡糖。具體操作方法為：將酶解后的卡拉膠寡糖溶于含有DMSO、10%的甲醇和1%的吡啶的混合溶液中，將混合物置于100 ℃反應4 h，用蒸餾水透析至少3 d，醇沉，濃縮，冷凍干燥即得脫硫卡拉膠寡糖。

1.3 磷酸化修飾

研究表明，磷酸酯化多糖水溶性明顯增強，具有抗氧化、抗腫瘤和抗衰老的活性［15-19］。常用的方法有磷酰氯法、磷酸鹽法和磷酸法 3 種。Chen 等［16］利用磷酰氯法制備了取代度不同的磷酸化多糖。制備過程如下：將磷酰氯試劑滴入無水吡啶中制備磷酸化試劑，多糖樣品溶于DMF，倒入含有磷酸化試劑的三頸燒瓶反應得磷酸化南瓜多糖。相比于其前體物，磷酸化多糖具有較強的抗氧化活性。在磷酸鹽法中，三聚磷酸鈉和三偏磷酸鈉常常被混合使用，Zhang 等［18］采用磷酸鹽法成功制備了磷酸基的含量為14.36%的磷酸化瓜蔞皮多糖。藥理活性結果表明，修飾后的瓜蔞皮多糖（磷酸基的含量為14.36%）比其前體物抗衰老能力顯著增強。

1.4 乙酰化修飾

有研究表明，乙酰基的引入能改變多糖分子的定向性和橫向次序，最終導致多糖羥基基團暴露，改變其物理性質，增加其在水中的溶解性，因此對其生物活性產生影響［41］。例如，對殼聚糖分子內活潑的氨基和羥基基團進行乙酰化修飾，能改善其溶解性，賦予殼聚糖更多的特殊功效［42］。斜頂菌多糖乙酰化修飾后，其抑瘤活性較修飾前有明顯提高，其原因除修飾基團自身因素外，還與修飾后水溶性改變有關［43］。梁進等［44］對茶多糖進行乙酰化修飾，發現乙酰化多糖能提高抗凝血活性。因此，利用乙酰化修飾進行分子改性是改善多糖理化性質、提高其藥理功能的一個重要途徑。

目前乙酰化修飾中，乙酸酐是最普遍適用的乙酰化試劑，主要有乙酸酐法、吡啶-乙酸酐法和DMF-乙酸酐法 3 種方法。Yang 等［21］在恒溫下滴加適量乙酸酐于pH 為9 羊肚菌多糖溶液，獲得乙酰化羊肚菌多糖（DS 最高為 0.4）。周林等［23］采用吡啶-乙酸酐反應體系，將裂褶多糖溶于DMSO，加入120μL 吡啶和不同體積的乙酸酐，透析液經干燥獲得乙酰化產物，經乙酰化修飾后的多糖分子量明顯降低。Liu 等［25］以 DMF 為溶劑將適量樣品溶解，無水乙酸酐緩慢滴入，反應10 h 后收集含有樣品溶液醇沉干燥即得乙酰化白芨多糖，在此條件下多糖的DS 為0.80。結果表明，DMF-乙酸酐法方便，易于控制產物的DS，修飾產物的水溶性明顯提高。

表1 多糖化學修飾方法匯總

1.5 去乙酰化修飾

去乙酰化修飾有助于挖掘多糖衍生物潛在的生物活性，研究乙酰基團的DS 和取代位置與其活性之間的構效關系。目前去乙酰化修飾的方法有NH2NH2-HIO3法和壓縮法。Zhang 等［26］為了探討硫酸軟骨素的去乙酰化產物的潛在生物活性，采用NH2NH2-HIO3法制備了去乙酰化硫酸軟骨素。將樣品軟骨硫酸鈉溶于含1%硫酸肼的無水肼溶液中，105 ℃密封孵育10 h，乙醇沉淀，復溶于5%醋酸溶液中，再添加0.5 mol HIO3，置于4 ℃冰箱2 h，乙醚反復萃取，NaOH 中和水相，然后醇沉，透析，冷凍干燥成功獲得目標產物。而He 等［27］采用壓縮法也成功對殼聚糖進行了去乙酰化修飾。將殼聚糖和適量NaOH 混合均勻后加蒸餾水稀釋至堿溶液濃度始終保持在5%～15%，反應容器置于高壓蒸氣滅菌鍋中反應，醇沉干燥獲得去乙酰化的程度高達95%乙酰化殼聚糖。此法借助了高溫，因此便捷且無污染。

1.6 羧甲基化修飾

茯苓是傳統中藥的“四君八珍”之一，具有廣泛的藥理活性，然而占茯苓高達93%的茯苓聚糖卻幾乎無抗腫瘤的作用，但如將其進行羧甲基化修飾后，不僅提高了水溶性，還具有很強的抗腫瘤活性［45］。羧甲基化修飾也是改善多糖生物活性非常重要的一個途徑。

目前羧甲基化修飾方法主要有水媒法和溶媒法兩種。水媒法是指多糖樣品溶于稀堿溶液，再加入鹵代酸試劑，而溶媒法則是指先將多糖溶于有機溶劑，再加入堿液堿化，最后加入鹵代酸于適宜條件反應。Wang 等［29］采用水媒法將青錢柳多糖溶于20%NaOH 溶液攪拌后靜置1 h，加入無水乙醇和一氯乙酸反應，透析液冷凍干燥即得羧甲基化多糖。

由于水媒法副反應較多，加入酸性試劑會產生黏稠物質，不易分離，故多糖羧甲基化時傾向于溶媒法。目前相比于水媒法，溶媒法被廣泛應用。Li等［46］采用溶媒法制備了羧甲基化羊肚菌多糖。將羊肚菌多糖置于含有20%NaOH 溶液的異丙醇溶液中，冰浴中攪拌反應3 h，室溫條件下緩慢滴加氯乙酸，透析，冷凍干燥即得羧甲基化羊肚菌多糖，研究表明羧甲基化多糖比其前體物具有較高的抗炎活性。

1.7 硒化修飾

有研究表明，硒化多糖的生物活性普遍高于多糖和無機硒且易被機體吸收和利用［47］。因此多糖的硒化修飾具有非常重要的理論意義和實踐價值。目前硒化方法主要有H2SeO3-HNO3-BaCl2法和亞硒酸鈉-稀硝酸法。Wang 等［33］運用 H2SeO3-HNO3-Ba?Cl2法將亞側耳多糖樣品溶于0.8%硝酸溶液，然后將適量亞硒酸與1 mol/L BaCl2溶液混合加入，以制得硒化亞側耳多糖 Se-HSP。Xiao 等［34］根據亞硒酸鈉-稀硝酸法制備硒化海藻多糖。

1.8 降解修飾

據報道，在一定分子量范圍內，一般多糖分子量越小，其表現的生物活性越強［48］，推測原因可能是因為小分子量的多糖可以自由穿梭生物膜。目前對于多糖的降解方法主要有H2O2-維生素C 法、Fe2+-H2O2法和超聲降解等。H2O2-維生素C 法、Fe2+-H2O2法是最常用的方法，這2 種方法都是將多糖樣品加水溶解，只是加入的催化劑不同，前者是加入等摩爾的H2O2和維生素C，后者是加入1%FeSO4和H2O2溶液，反應液在室溫條件下反應2 h，透析后即得目標降解多糖。H2O2-維生素C 法獲得的枸杞葉多糖降解后在水溶液中由先前的球形結構變為雜亂的環狀［35］，降解后抗血小板活性也隨之提高，Fe2+-H2O2法制備的降解后的黑加侖多糖主要結構沒有變化［36］，且多糖分子量越小，其生物活性越強，超聲降解后的多糖的抗氧化活性雖略有提升，但其三螺旋結構遭到了破壞［37］。

2 多糖衍生物結構鑒定

2.1 紅外圖譜

紅外光譜在取代多糖的定性和定量分析中發揮著非常重要的作用，而且方便快捷，因此多糖的衍生化成功與否以及衍生化程度往往首先通過FT-IR 圖譜檢測。多糖經不同方法改性后的多糖衍生物的紅外特征峰歸納見表2。

多糖經硫酸化或去硫酸化后S=O、S-O 和C-OS 伸縮振動峰會發生相應變化，硫酸酯化后的黑木耳多糖在1 235 cm-1新出現了不對稱的S=O 伸縮振動峰［10］，在819 cm-1出現了對稱的 C-O-S 振動峰；同樣，仙人草多糖在硫酸酯化后［12］在1 260 cm-1出現了不對稱的S-O 伸縮振動峰，在814 cm-1出現了C-OS 伸縮振動峰。多糖經乙酰化或去乙酰化后會，出現新的或減少C=O 伸縮振動峰和羧基伸縮振動峰。青錢柳葉多糖經乙酰化修飾后，在1 240 cm-1的吸收峰隨著乙酰基取代度的增加而增加［50］。金耳多糖去乙酰化后，與天然多糖TAPA1 相比，在1 733.7 cm-1和 1 249.7 cm-1的吸收峰消失［24］，表明乙酰基團被完全去除。硒化的海藻多糖在675 cm-1出現了不對稱的 Se-O-C 的伸縮振動吸收峰［34］。

2.2 核磁共振圖譜

分子改性后的取代基在NMR 上會出現特有的信號峰，因此可以通過NMR 圖譜信息變化來驗證多糖衍生化成功與否。Chen 等［52］通過比較硫酸化黃瓜多糖與其前體物（黃瓜多糖）的NMR 圖譜結果，13C NMR 圖譜中 δ 109～110 ppm 出現了新的共振峰，印證了硫酸化的成功發生。多糖磷酸化改性后，可以很容易地通過31P NMR 新出現的信號峰得到證實［53］。Chen 等［17］通過31P NMR 上在 δ-30-5 ppm 新出現的3 個信號峰印證了磷酸化成功發生，結合13C NMR上C2，C3，C5的化學位移的變化，最終確認了有3個磷酸化位點。瓜蔞皮多糖磷酸化后在31P NMR 圖譜中，在δ 0.95～1.73 ppm 區域出現了較強的且較多的磷共振吸收峰，表明瓜蔞皮多糖磷酸化成功發生［18］。乙酰化修飾是否成功發生，可以通過下列信息進行確認。乙酰基中甲基碳的信號在δ 20～22 ppm，甲基氫的信號在δ 1.8～2.2 ppm，乙酰基的羰基信號在δ 170～180 ppm，與此同時，在HMBC上會有甲基氫和羰基的共振信號出現［54］。Du等［24］從金耳多糖分離的一種天然酸性多糖TAPT1含有0.7%的乙酰基（DS為0.03）。為進一步提高其活性，對TAPT1 分別進行乙酰化（TAPT1-ac）和去乙酰化（TAPT1-de）等化學修飾，TAPT1-ac 和 TAPT1-de 的 DS 分別為 0.23和 0。TAPT1 中因為有乙酰基的存在，在1H NMR δ 2.02 ppm 處 和13C NMR δ 23.79 ppm 處均有信號峰出現。乙酰化多糖TAPT1-ac在δ 2.02 ppm和δ 23.79 ppm 處的信號明顯高于金耳多糖TAPT1，表明TAPT1 乙酰化成功發生；而在去乙酰化產物TAPT1-de 的NMR中，δ 2.02 ppm 和δ 23.79 ppm 處的信號完全消失，表明去乙酰化成功發生。Chen 等［55］采用水媒法制備了羧甲基苦瓜多糖，與其前體物相比，羧甲基化多糖在13C NMR δ 70 ppm 處的信號明顯增強，表明羧甲基化改性成功。黑木耳多糖羧甲基化后在13C NMR δ 170～180 ppm處出現了新的信號峰，表明羰基存在，結合FT-IR 圖譜結果證實了羧甲基化成功發生［30］。

表2 衍生化多糖紅外特征吸收峰

基團的取代位置也是多糖結構的一個重要參數。多糖衍生化之后取代基團會影響13C NMR 和1H NMR 的化學位移，可以通過NMR 確定衍生化多糖中取代基團的位置。有研究發現，多糖硫酸化后直接與吸電子的硫酸鹽基團相連的碳原子會向較低的磁場位置移動，而間接相連的碳原子則會向較高的磁場位置移動［56］，這個規律被稱為苷化位移規則，即糖上的羥基被其他基團取代后，其相連羥基碳的化學位移將向低場移動［57］。而且，糖環上不同位置的碳原子發生取代后，不管是雙糖、寡糖還是多糖，只要取代基相同，其向低場的化學位移數值基本一樣［58］。被硫酸基取代后，被取代位置的碳的化學位移向低場移動6～9 ppm，通過比較硫酸酯多糖脫硫前后的13C NMR 譜（必要時，還要綜合紅外和化學實驗結果），可以確定硫酸基在糖環上的取代位置［53，57］。 Liang 等［56］通過比較硫酸化前后多糖的13C NMR 圖譜信號特征，確定了取代位置發生在C-2 和C-6 上［59］，其中 C-2 被硫酸化后 C-2 的化學位移由 63.7 ppm 向低場移動了3.3 ppm（為δ67.0 ppm），而且隨著DS 的增加，取代硫酸基團的碳的電子環境變得復雜，信號的重疊越來越嚴重，所以僅從13C NMR 譜圖確定取代位置還有很大的局限性。

3 展望

多糖的結構決定了其功能，其中取代基團的種類、取代位置和數量（以取代度或含量表示）都是多糖重要的結構參數，不僅影響其溶解度、分子量等理化性質和空間結構，更重要的是能改變多糖的生物活性。很多研究表明，改性后的多糖產品已經展現了廣泛的藥理活性，包括抗氧化、抗腫瘤、增強免疫、抑菌等，特別是改性后的香菇多糖的抗病毒（HIV）活性在臨床上已經成功應用。因此，多糖的化學修飾是多糖藥物化學研究的一個重要分支，是提高天然多糖活性的一個重要途徑。因此，多糖的化學修飾具有廣闊的發展前景。

近幾年，多糖的化學修飾雖有了廣泛研究，但是尚顯不足。①目前的分離純化技術多糖制備效率不高，致使所得純品量少不足以衍生化和結構分析，以后要加強分離純化工藝技術和流程的研究，提高純化效率，制備出更多的多糖純品。②多糖化學修飾方法的針對性、有效性和可控性還不夠高，應該加強化學修飾方法和工藝條件的篩選與優化，增加取代參數（如DS、取代位置）和分子量等方面的可控性。③目前多糖衍生化采用的先導化合物有些不是純品，導致試驗結果的重現性不好，衍生產品的取代位點和數量不穩定，以后應盡量采用均一多糖作為衍生化的試驗對象，提高試驗結果的穩定性和重現性。④目前工作主要集中在化學修飾方法的優化和藥理活性的提高方面，改性后多糖的結構鑒定方面的研究報道不多，不利于分析和闡明多糖的構效關系。