外源5-氨基乙酰丙酸對干旱脅迫下黃瓜種子萌發及幼苗生長的影響

鄧碩真，劉惠軍，王洪芹，王紅艷，張倩茹，張 梅

（中國農業大學煙臺研究院，山東 煙臺 264670）

中國具有水資源短缺、分布不均衡、過分利用從而導致大量浪費等問題，目前大面積土地處于干旱和半干旱區域，水資源的不足嚴重抑制了農業的生產和發展。在干旱環境下，植物細胞的膨壓下降、葉片萎蔫下垂，在極度干旱的環境下，植物細胞嚴重脫水，體內各個生理生化反應混亂失調，嚴重的情況下則會促使植物死亡［1］。中國糧食和蔬果的產量和質量深受干旱條件制約。黃瓜（Cucumis sativusL.）屬于中國普遍種植的蔬菜種類，因其鮮嫩多汁、富含養分而深受人們喜愛，栽種面積大、分布廣。但是黃瓜是淺根性作物，面對環境的水分變化敏感度高，整個生命周期大量需水，抵御干旱的能力不足。因此探索具有提高黃瓜抗旱性功能的外源生長物質具有重要意義。

5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid，ALA）又名δ-氨基乙酰丙酸，是一種非蛋白氨基酸，廣泛分布于動植物機體活細胞中，是合成葉綠素、血紅素和維生素B12等四吡咯環色素的必要前體物質，在生物體的多種生物化學反應發揮重要作用［2］。前人試驗發現，5-ALA 具有提高菠菜幼苗抗氧化酶活性［3］；提高葉綠素b 含量從而穩定LHCⅡ脫輔基蛋白結構［4］；促進鹽脅迫下酸棗種子萌發［5］；促進愈傷組織不定根不定芽分化［6］；提高棉花［7］、草莓［8］等多種植物的抗鹽性以及提高甜瓜［9］、黃瓜［10］等瓜類抗冷性的功效，是一種杰出的外源植物生長調節劑，被普遍應用于農業環境調控研究。但是有關5-ALA 提高植物抗旱性的探究較少。PEG-6000（聚乙二醇）是一種理想的高分子滲透劑，滲透壓穩定，限制植物水分吸收速率，可以用于干旱缺水環境的模擬。

為此，以津耘五號黃瓜種子及幼苗作為試驗材料，采用20% PEG-6000 進行根灌處理，不同濃度的5-ALA 進行葉面噴施處理，探索5-ALA 對干旱脅迫下黃瓜種子的萌發及黃瓜幼苗的生長發育是否具有緩解作用，并確定效果最明顯的5-ALA 濃度，以期為黃瓜的種植栽培提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的黃瓜種子為津耘五號，購自天津子豐種業有限公司，5-ALA 由山東深海生物科技股份有限公司提供，現用現配。PEG-6000 的濃度為20%（由預試驗確定）。

1.2 種子萌發生理指標測定

選取大小均一、顆粒飽滿、完整無破損的黃瓜種子 1 050 粒，經過0.1%（W/V）HgCl2消毒15 min 后，反復清洗直至除去殘留。將種子投入55～60 ℃的溫水處理10～15 min，用玻璃棒攪拌，待水溫降到20～30 ℃，將其放置在25 ℃恒溫箱內浸種4～6 h。浸種后的種子隨機分為7 組，培養在直徑為9 cm，內鋪一層濾紙的培養皿中。每組3 個培養皿，各有黃瓜種子50 粒，以此作為3 次重復。試驗組設置為雙蒸餾水空白對照（T0）、20% PEG-6000 處理（T1）以及在T1 基礎上分別加入 0.05 mg/L（T2）、0.5 mg/L（T3）、1.0 mg/L（T4）、5.0 mg/L（T5）、10.0 mg/L（T6）的5-ALA。將培養皿置于25 ℃培養箱中培養3 d，每天更換溶液，并保持空氣暢通，記錄發芽種子數，第3 天量取發芽種子芽長度，并計數全部芽長大于2 mm 的黃瓜種子。測量記錄后計算種子的發芽率（Gr）、發芽指數（Gi）和活力指數（Vi），計算公式如下：

發芽率（Gr）=（3 d 內發芽的種子數/試驗種子總數）×100%

發芽指數（Gi）=ΣGt/Dt

式中，ΣGt為第3 天發芽數，Dt為發芽天數。

活力指數（Vi）=Gi×S

式中，S為第3 天幼根平均長度。

1.3 幼苗生理指標測定

選取飽滿、大小一致的黃瓜種子于55～60 ℃的溫水浸種后，放置于25 ℃恒溫箱中催芽至露白，播于32 孔穴盤中，定期定量灌溉。待幼苗長至兩葉一心時，選取長勢相同的黃瓜幼苗移栽至盆中，分為7個試驗組，每組24 株，3 次重復。試驗組設置為雙蒸餾水空白對照（T0）、20% PEG-6000 處理（T1）以及在T1基礎上分別加入0.05 mg/L（T2）、0.5 mg/L（T3）、1.0 mg/L（T4）、5.0 mg/L（T5）、10.0 mg/L（T6）的5-ALA。緩苗后，向幼苗根灌20% PEG-6000溶液1次，澆透為止。7 d后，傍晚向幼苗葉片噴施5-ALA溶液，葉片反面滴水為限，每3 d 噴施一次，處理后12 d 取樣測定，測定的生理指標包括黃瓜幼苗的株高、莖粗、根冠比、干重、壯苗指數、根系活力、可溶性糖含量、游離脯氨酸含量及光合色素含量。

1.3.1 幼苗生長指標測定 將幼苗在營養土中挖出，用去離子水洗凈植株，將地上和地下部分分離，擦干。量取植株莖底部到生長點的間隔，記為株高，量取地上部1 cm 處莖粗。將樣品于105 ℃下烘干至恒重，用分析天平稱量其干重。計算壯苗指數的公式為：

壯苗指數=（地下部干重/地上部干重+莖粗/株高）×全株干重

1.3.2 幼苗生理指標測定 黃瓜幼苗游離脯氨酸含量測定采用水合茚三酮法［11］，用 μg/g FW 表示其含量，使用紫外分光光度計進行比色。可溶性糖含量采用蒽酮法［11］測定，用紫外分光光度計測其在630 nm 處的吸光度，用mg/g FW 表示含量。根系活力的測定采用2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法［12］，光合色素含量采用趙世杰等［12］的方法，用80%丙酮提取后比色。

1.4 數據分析

對3 組重復的數據取平均值，用SPSS 18.0 進行方差分析，用LSD法進行多重比較，顯著性差異水平為P＜0.05，用Origin 進行圖表的繪制。

2 結果與分析

2.1 不同濃度5-ALA 處理下黃瓜種子的發芽指標

由表1 可知，20% PEG-6000 處理下黃瓜種子萌發受到嚴重抑制，黃瓜種子發芽率、發芽指數、活力指數均處于最低水平。隨著5-ALA 濃度的提高，黃瓜種子發芽率、發芽指數、活力指數首先呈上升趨勢，當5-ALA 濃度達到0.5 mg/L 時，發芽率、發芽指數、活力指數均達到最大值。發芽率為92.3%，相對于T1（干旱處理）黃瓜種子發芽率（59.7%）提高了32.6個百分點，與T0（蒸餾水）處理發芽率（92.1%）無顯著差異；發芽指數為15.39，相對于T1（干旱處理）黃瓜種子發芽指數（9.94）提高了54.83%，與T0（蒸餾水）處理黃瓜種子發芽指數（15.35）無顯著差異；活力指數為74.47，是T1（干旱處理）活力指數（10.69）的6.97 倍，與T0（蒸餾水）處理黃瓜種子的活力指數（70.82）無顯著差異。隨著5-ALA 濃度進一步提高，黃瓜種子發芽率、發芽指數、活力指數均明顯出現下降趨勢，當 5-ALA 濃度為 10.0 mg/L（T6）時，黃瓜種子活力指數（19.61）與T1（干旱處理）無顯著差異，說明不同濃度的5-ALA 能夠緩解干旱脅迫對黃瓜種子萌發的限制作用，在試驗處理中，0.5 mg/L 5-ALA效果最好，過高濃度的5-ALA 對干旱脅迫下黃瓜種子發芽的促進作用反而不明顯。

表1 不同濃度5-ALA 處理下黃瓜種子發芽指標

2.2 不同濃度5-ALA 處理下黃瓜幼苗的生長指標

在干旱缺水條件下，植物一般通過形態上的變化來順應外部環境。由表2 可知，葉面噴施5-ALA明顯緩解了干旱環境對黃瓜幼苗生長發育的抑制，隨著5-ALA 濃度的升高，黃瓜幼苗的株高、莖粗、根冠比、干重、壯苗指數首先呈上升趨勢。其中T3（0.5 mg/L）的緩解效果最好，株高、莖粗、根冠比、干重和壯苗指數相對于T1（干旱處理）分別提高了43.08%、37.41%、30%、99.13%和104.51%，與T0（蒸餾水）處理無顯著差異。隨著5-ALA 濃度的繼續提高，各指標明顯出現下降走勢。當5-ALA 濃度為10.0 mg/L（T6）時，黃瓜幼苗的莖粗、根冠比、干重及壯苗指數與T1（干旱處理）無顯著差異，說明高濃度的5-ALA 對黃瓜植株的生長發育和形態建成的促進效果不明顯。

表2 不同濃度5-ALA 對黃瓜幼苗生長的影響

2.3 不同濃度5-ALA 對黃瓜幼苗滲透調節物質含量的影響

游離脯氨酸和可溶性糖在植物細胞內發揮滲透調節的作用，其含量和植物抗旱性呈正相關。如表3 所示，T1（干旱處理）下，黃瓜植株游離脯氨酸含量和可溶性糖含量均明顯高于T0（蒸餾水）處理，表明黃瓜幼苗此時處于滲透脅迫中。隨著5-ALA 濃度的提高，黃瓜幼苗體內游離脯氨酸和可溶性糖含量均呈現先上升后下降的趨勢。當5-ALA 濃度為0.5 mg/L 時，黃瓜幼苗體內的游離脯氨酸和可溶性糖含量到達最大值，此時游離脯氨酸含量為65.26 μg/g FW，相對于T1（干旱處理）下游離脯氨酸含量（24.77 μg/g FW）提高了163.46%；此時可溶性糖含量為60.40 mg/g FW，相對于T1（干旱處理）下可溶性糖含量（42.90 mg/g FW）提高了40.79%。當用10.0 mg/L（T6）的5-ALA 處理黃瓜幼苗時，其可溶性糖和游離脯氨酸含量都明顯低于T3（0.5 mg/L）處理，此時可溶性糖含量與T1（干旱處理）無顯著差異，說明不同濃度的5-ALA 能夠提高干旱條件下黃瓜植株體內滲透調節物質的含量，從而增強其抵御干旱的能力。在本試驗處理中，0.5 mg/L 5-ALA 效果最好，過高濃度的5-ALA 對黃瓜幼苗抗旱性提高的效果反而不明顯。

表3 不同濃度5-ALA對黃瓜幼苗滲透調節物質含量的影響

2.4 不同濃度5-ALA 處理下黃瓜幼苗的根系活力

植物根系是直接吸水器官，最先感受干旱脅迫，并立即啟動一連串抗旱響應機制，根系活力的高低也會受到影響［13］。由圖1 可知，在干旱脅迫下，隨著5-ALA 濃度的提高，黃瓜幼苗根系活力逐漸增強，當5-ALA 濃度達到0.5 mg/L 時，根系活力最強，為121.0 μg/g FW·h，相對于 T1（干旱處理）根系活力（71.0 μg/g FW·h）提高了70.42%，與T0（蒸餾水）處理根系活力（129.3 μg/g FW·h）無顯著差異。5-ALA濃度進一步提高，黃瓜幼苗根系活力則呈現下降趨勢，T6（10.0 mg/L）根系活力（77.7 μg/g FW·h）顯著低于T3（0.5 mg/L），與T1（干旱處理）無顯著差異。

圖1 不同濃度5-ALA 處理下黃瓜幼苗根系活力

2.5 不同濃度5-ALA 處理下黃瓜幼苗的光合色素含量

干旱脅迫會引起葉綠體的解體及光合色素降解，從而阻止光合作用的正常運行。因此光合色素含量表征了植物抗旱能力的強弱。如表4 所示，在干旱環境下，黃瓜幼苗的葉綠素和類胡蘿卜素含量最低，隨著不同濃度5-ALA 的加入，有了不同程度的提高。0.5 mg/L 5-ALA 處理下，黃瓜幼苗葉綠素和類胡蘿卜素含量達到峰值，此時葉綠素含量顯著高于T0（蒸餾水）處理，相比T0（蒸餾水）提高了16.55%，相比T1（干旱處理）提高了38.59%；此時類胡蘿卜素含量與T0（蒸餾水）無顯著差異，相對于T1（干旱處理）提高了126.92%。隨著5-ALA 濃度的繼續提高，黃瓜幼苗葉綠素和類胡蘿卜素含量逐漸下降。當用 5.0 mg/L（T5）的 5-ALA 處理時，類胡蘿卜素含量與T1（干旱處理）無顯著差異。

表4 不同濃度5-ALA 對黃瓜幼苗光合色素含量的影響

3 小結與討論

種子萌發期對環境變化十分敏感，種子的發芽特性決定了其成苗率，進而影響幼苗的生長發育和形態建成，影響果實的產量和品質。本試驗表明，經過5-ALA 處理后，黃瓜種子的發芽率、發芽指數和活力指數相對于干旱環境都有不同程度的提高，其中以0.5 mg/L 5-ALA 處理下最高，這與張春平等［14］研究的甘草種子結果相似。

PEG-6000 模擬的干旱環境明顯抑制了黃瓜幼苗的生長發育。其株高、莖粗、根冠比、干重、壯苗指數和根系活力等指標均顯著低于蒸餾水環境中生長的幼苗。在加入外源5-ALA 后，每項生長指標都有不同程度的增加，說明葉面噴施5-ALA 可以提高幼苗對干旱環境的抵御能力。這與何娟等［15］研究的發現外源5-ALA 可緩解干旱脅迫對香蕉幼苗生長發育的遏制是相似的。隨著加入的5-ALA 濃度的提高，其對干旱脅迫的緩解作用呈現先上升后下降的趨勢，其中峰值為0.5 mg/L，高濃度的5-ALA 緩解作用反而很低，這與王宏信等［16］的試驗結果相似。

可溶性糖和游離脯氨酸屬于植物細胞內的滲透調節物質，在干旱條件下會發生累積。它們含量的增加有助于增大細胞液濃度，降低細胞內的水勢，增強細胞保水能力［17］，從而維系細胞膨壓，促進細胞分裂擴大，避免植物萎蔫；有助于維持氣孔運動，促進CO2的吸收，從而保證光合作用正常運行，防止干旱條件下光抑制的發生［18-20］。脯氨酸還具有除去活性氧［21］，防止生物膜破壞的作用；作為無毒害氮源合成葉綠素；與蛋白質結合，增強其溶解性［22］等功能。因此植物體內游離脯氨酸和可溶性糖含量越高，其抵抗干旱的能力也就越強。試驗結果顯示，在干旱環境下，隨著5-ALA 濃度的增加，可溶性糖和游離脯氨酸的含量呈現先上升后下降的趨勢，于0.5 mg/L 達到最大值，幼苗的抗旱性也最強。

干旱環境下，植物的氣孔導度降低，CO2的不足及酶活性的下降抑制了光合碳同化的進行，進而抑制光合電子傳遞，降低植物的光飽和點，弱光便會導致光能過剩，從而發生光抑制［23］，產生過氧化物損傷葉綠體膜系統，致使葉綠素和類胡蘿卜素降解破壞而含量降低。葉綠素和類胡蘿卜素是維持植物正常光合作用的重要物質，它們能夠吸收、傳遞和轉化光能，其含量與植物光合強度有直接關系。此外，葉黃素循環具有熱耗散、穩定類囊體膜的結構、抑制膜脂過氧化等作用［24］，因此它們在維持光合結構的穩定性、抵御光抑制，維持植物同化生成有機物的能力等方面具有重要作用。在干旱條件下葉綠素含量和類胡蘿卜素含量越高，植物抵御光破壞的能力就越強，植物抗旱性也越高。本試驗表明在PEG-6000模擬的干旱環境下，5-ALA 的加入提高了幼苗體內葉綠素和類胡蘿卜素的含量，其中以0.5 mg/L 效果最佳，高濃度的5-ALA 緩解效果反而下降，兩者含量的提高不明顯，這與偶春等［25］對梔子幼苗相關研究結果相似。5-ALA 是形成葉綠素的關鍵前體物質，在一系列酶的作用下合成原葉綠素酸酯，最終形成葉綠素，5-ALA 的合成是植物體中合成葉綠素等四吡咯的限速步驟。相關研究發現［26］，外源噴施5-ALA 可以上調草地早熟禾葉片內膽色素原合成酶、尿卟啉原脫羧酶、原葉綠素酸酯還原酶等與卟啉和葉綠素生物合成有關的催化酶基因表達，增強酶的活性，提高膽色素原、原卟啉IX、原葉綠素酸酯等中間產物的含量，并促進中間產物向下游產物的轉化，從而促進葉綠素的合成；同時外源5-ALA 能通過上調內源5-ALA 合成途徑相關酶基因的表達，來促進內源5-ALA 的合成，進一步促進葉綠素的合成。因此5-ALA 處理下黃瓜幼苗體內葉綠素含量提高的作用機理可能與之相似。

綜上，葉面噴施不同濃度5-ALA 可以不同程度地促進干旱脅迫下黃瓜種子的萌發，促進幼苗體內光合色素含量及滲透調節物質含量的提高，促進生物量的積累從而促進其生長發育和形態建成。其中以0.5 mg/L 處理效果最佳，在此濃度下，黃瓜種子的發芽狀況及黃瓜幼苗的各項生長和生理指標均顯著高于干旱環境，過高濃度的5-ALA 對植物抗旱能力的提高反而不明顯。