2，4-表油菜素內酯對紫花苜蓿高溫脅迫生理特性的影響

黃一龍，龐天德，史 靜，韋錦益，姚 娜

（廣西壯族自治區畜牧研究所，南寧 530001）

廣西地處中國南方亞熱帶季風氣候區，水熱同期，年均溫大于等于10 ℃，具有良好的植物生長條件優勢。但每年從5 月開始進入高溫高濕氣候，致使很多暖溫帶地區生長的優質牧草如苜蓿、黑麥草、紫云英等不能越夏，在廣西地區只能作為冬季牧草使用，使用時間短，每年都需要重復種植，極大地提高了種植成本，降低了使用效率。

大量的研究表明，植物的耐熱性與其自身代謝具有很大的關系［1］。高溫條件下，植株體內會發生一系列生理變化，滲透調節能力降低，細胞活性氧的產生與清除平衡被打破，抗氧化酶防御系統以及光合系統均會發生一系列變化，對植物的生長發育造成很大影響，甚至死亡［2-4］。近年來，應對植物的高溫脅迫，除了篩選耐高溫品種以外，外源保護劑的應用對熱應激下的植物生長也具有積極作用［1］。油菜素內酯（Brassinolide，BR）是甾醇類植物生長激素，活性高，具有較強的廣普性，現已被確認為第6 類植物激素［5］。對植物逆境脅迫高溫、干旱、高鹽以及病害等具有抗性作用，能增強細胞的分裂和伸長，促進作物生長，增強光合作用，提高生物產量，調節植物的生理代謝功能，提高抗逆性，保護植物免受逆境脅迫［6］。2，4-表油菜素內酯（2，4-Epibrassinolide，EBR）作為人工合成的高活性油菜素內酯類似物，被廣泛地應用于農業生產［6，7］。在茶樹［7］、水稻［8］、花卉牡丹［5］、除蟲菊［9］以及番茄［10］、茄子［11］、龍須菜［12］、西葫蘆［6］等蔬菜應對高溫脅迫的研究中有較多應用，但在紫花苜蓿的耐熱性研究上鮮見報道。為此，試驗運用外源激素2，4-表油菜素內酯對高溫脅迫下的紫花苜蓿（Medicago sativaL.）進行抗高溫脅迫機理研究，探索外源激素調控紫花苜蓿的抗逆生理機制，提高抗熱性，降低高溫損害，延長南方冬季型牧草的使用壽命，提高利用效率，以期解決暖溫帶的優質牧草在南方畜牧業的應用及生產上的局限性問題。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

試驗選擇紫花苜蓿WL525 為試驗材料，購于百綠（天津）草業有限公司。將紫花苜蓿栽種于花盆中，待長至3 個月苗齡時，選取長勢基本一致的苜蓿幼苗放入人工氣候箱，置于人工智能氣候箱中模擬高溫環境脅迫。預培養15 d，光照度3 000 lx，晝/夜溫度25 ℃/15 ℃，濕度80%，光照12 h，黑暗12 h。試驗設 0（對照）、0.05、0.10、0.50、1.00 mg/L 5 個梯度外源激素EBR濃度，其中對照噴施無菌水。1周后進行葉面噴施外源激素處理。連續噴施3 d，第3 天噴施結束2 h 后，將溫度調節至晝/夜溫度42 ℃/30 ℃，光照、濕度及光照時間相同，分別于 0、3、6、12、24 h 后取樣（成熟葉片），放入液氮中速凍，再轉入-40 ℃冰箱保存備用，檢測樣本的脯氨酸含量、可溶性蛋白質含量、過氧化物酶（POD）及超氧化物歧化酶（SOD）活性。

1.2 生理指標測定

脯氨酸用磺基水楊酸溶液提取后，采用茚三酮比色法［13］進行測定；可溶性蛋白質含量采用考馬斯亮藍比色法［13］測定；POD 活性采用愈創木酚法［13］測定；SOD 活性采用氮藍四唑NBT 法［13］測定。

1.3 統計與分析

試驗數據以（平均值±標準誤）表示，利用Excel軟件建立原始數據庫并制圖表，采用DPS 13.5 軟件對數據進行顯著性檢驗和多重比較分析。

2 結果與分析

2.1 高溫脅迫下EBR 對紫花苜蓿游離脯氨酸含量的影響

隨著高溫脅迫時間的延長，不同處理的紫花苜蓿游離脯氨酸含量均呈上升趨勢。其中0.10 mg/L EBR 處理下游離脯氨酸含量上升最快，24 h 達到（59.85±10.65）μg/g，較對照提高了54.25%，其次為0.50 mg/L EBR 處理，24 h 游離脯氨酸含量為（57.55±7.50）μg/g，較對照提高了48.32%（圖1）。

圖1 EBR 對高溫脅迫下紫花苜蓿游離脯氨酸的影響

2.2 高溫脅迫下EBR 對紫花苜蓿可溶性蛋白質含量的影響

高溫脅迫下，紫花苜蓿對照組可溶性蛋白質含量呈先上升后下降的變化趨勢。但隨著EBR 的施用，可溶性蛋白質含量在先上升再下降后又呈逐漸回升的趨勢，0.10 mg/L EBR 處理分別在 3、6、12 和24 h時均處于最高值，其中在12 h時達到28.55 mg/g，較對照組提高59.68%，差異顯著（P＜0.05）（圖2）。

圖2 EBR 處理對高溫脅迫下紫花苜蓿可溶性蛋白質含量的影響

2.3 高溫脅迫下EBR 對紫花苜蓿抗氧化代謝指標的影響

在高溫脅迫下，不同濃度EBR 處理紫花苜蓿使其對抗氧化酶活性指標呈現不同程度的變化。從POD 活性的變化規律來看，在高溫脅迫下3 h 內POD 指標具有較高活性，呈上升趨勢，隨著脅迫時間的延長活性逐漸降低。但在相同時間內，EBR 處理能夠顯著提高POD 活性，其中，0.10 mg/L EBR 處理在高溫脅迫下POD 活性較對照提高了15.38%～63.99%（圖3）。從SOD 活性的變化規律來看，高溫脅迫下，紫花苜蓿SOD 活性呈先上升后下降的趨勢。在高溫脅迫處理0、3、6 h時，0.10 mg/L EBR 處理具有明顯優勢，較對照組高出22.69%～38.66%；隨著高溫脅迫處理時間的延長，12 h 和24 h 時，0.05 mg/L EBR 處理產生的SOD 活性最高，分別較對照高出15.64%和14.41%。

圖3 EBR 處理對高溫脅迫下紫花苜蓿POD 活性的影響

圖4 EBR 處理對高溫脅迫下紫花苜蓿SOD 活性的影響

3 小結與討論

夏季高溫是直接影響紫花苜蓿生長發育的主要生態環境因素之一。在高溫的脅迫下，紫花苜蓿生長發育受阻，體內物質運輸與光合系統遭受破壞，多個抗氧化酶活性下降，生理代謝失衡，抗旱、抗病蟲害的能力也隨之下降［14，15］。高溫再伴隨著病蟲害的發生，紫花苜蓿就會生長緩慢，枯萎甚至死亡。紫花苜蓿在受到高溫脅迫后，自身也會對脅迫產生一系列的應對反應，主要體現在細胞膜系統、滲透調節系統、抗氧化系統和光合系統 4 個方面［4，15］。其中，脯氨酸作為植物的滲透調節物質，主要起到平衡原生質與環境的滲透功能，保持植物膜結構的完整性，在正常情況下含量較少，但會隨著外來脅迫逐漸積累，對植物的滲透調節系統進行保護，是抵御外界脅迫的重要信號之一。試驗中，噴施EBR 溶液使紫花苜蓿體內的游離脯氨酸含量較對照有明顯提升，且隨著脅迫時間的延長呈上升趨勢，噴施濃度為0.10 mg/L效果最佳，由此可見，噴施EBR 溶液可以在高溫逆境中促進脯氨酸的積累，改善細胞膜透性，與王震等［6］在2，4-表油菜素內酯應對高溫脅迫下的西葫蘆幼苗生理及光合特性研究以及高健等［8］在2，4-表油菜素內酯緩解水稻花期高溫脅迫的生理機制研究中結果一致。

可溶性蛋白質也是植物在逆境中應對脅迫的重要標志之一。它具有較強的親水力，隨著脅迫大量產生，保護細胞膜，明顯增加細胞親水力、原生質彈性以及束縛水含量，調節平衡細胞與環境的滲透壓，從而緩解高溫等對植物的傷害［16，17］。本試驗中，外源EBR 對紫花苜蓿可溶性蛋白質的累積具有顯著的作用效果，且隨著脅迫時間的延長差異明顯，說明外源EBR 能夠通過迅速積累提高可溶性蛋白質含量，增加紫花苜蓿的細胞滲透調節作用，提高植物的抗高溫能力。這與吳雪霞等［11］在外源EBR 對高溫脅迫下茄子幼苗生長中可溶性蛋白的研究以及任增斌等［5］在外源EBR 對于牡丹耐熱性中可溶性蛋白質的研究結果一致。

高溫脅迫下，植物細胞內會產生大量的自由基，脂膜發生過氧化現象，正常的生理代謝功能遭受損害［4］。此時，植物會通過一定的酶學機制來抵御或修復逆境對細胞所造成的傷害，從而保護植物體的正常生長。其中過氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）等就可以通過調節其活性，來清除高溫脅迫所帶來的過剩自由基和活性氧，保護自身細胞免受氧化傷害。而通過外源激素EBR的處理，能夠進一步的提高POD 和SOD 的活性，緩解高溫脅迫所帶來的傷害，在李志鑫等［7］利用外源激素EBR 誘導茶樹耐熱性生理機制研究和華智銳等［18］在小麥幼苗抗旱性的誘導效應研究結果中均可以看出。本試驗中EBR 對高溫脅迫下紫花苜蓿的POD 和SOD 活性均較對照有明顯的提高，且保持較高的活性程度，說明EBR 對高溫脅迫下的紫花苜蓿酶反應機制敏感，且效果比較理想，緩解了高溫脅迫對紫花苜蓿的傷害。

綜合分析來看，外源2，4-表油菜素內酯作為一種高活性的植物激素，對高溫脅迫下的紫花苜蓿具有一定的保護作用，能夠降低高溫對紫花苜蓿滲透調節系統和抗氧化系統的傷害，提高紫花苜蓿的耐熱性，其中以0.10 mg/L 效果最好，為紫花苜蓿的抗高溫栽培提供了基礎理論依據。