基于植物皂素提取液為發酵基質的酶表達及洗滌性能研究

劉玉婷，張瑜婷，藍素桂，陳鈺泉，李 麗，譚 強

（廣西中醫藥大學藥學院，南寧 530001）

皂素是一種高分子量糖苷，由與三萜苷或甾體苷元相連的糖基部分組成［1］。它們廣泛分布在植物特別是一些草本植物或植物種子中，包括無患子、艾葉、皂莢、油茶子等［2-4］。皂素是天然的非離子表面活性劑，具有較好的洗滌性能，在水中能產生穩定、細膩豐富的泡沫［1］。皂素與人工合成的化學表面活性劑相比，具有來源廣泛、生物降解性好、天然且低毒等優點，因此被廣泛用于化妝品和洗滌劑等行業［5］。

許多酶試劑包括脂肪酶（E.C.3.1.1.3）、蛋白酶（E.C.3.4.21.14）和果膠酶（E.C.3.2.1.15）等被添加到化妝品和洗滌劑產品中，用于提高去污力和改善洗滌性能［6，7］。脂肪酶能催化三酰基甘油中羧基酯鍵裂解，隨后釋放脂肪酸和甘油，用于水解油脂，在洗滌劑行業有巨大的市場［8］。目前脂肪酶生產主要為微生物發酵法，芽孢桿菌（Bacillussp.）是脂肪酶主要的產生菌［9］。蛋白酶又稱肽酶，是作用于蛋白質的肽鍵，將其水解成多肽和氨基酸，存在于所有的生物體內［10］。蛋白酶應用廣泛，是國內銷量巨大的酶制劑［11］。蛋白酶生產也主要為微生物發酵法，產生菌主要為芽孢桿菌［12］。果膠酶作為果膠類物質的水解酶，廣泛存在于高等植物和各種微生物中，其中微生物中歐文氏桿菌（Erwiniasp.）、芽孢桿菌、假單胞桿菌（Pseudomonassp.）、曲霉屬（Aspergillussp.）和灰霉菌屬（Botrytissp.）等都能表達果膠酶［13-15］。果膠酶應用于皮革、絲綢等行業，在食品、飼料，特別是醫藥領域植物藥的提取和洗滌等方面［16］。脂肪酶、蛋白酶和果膠酶等已是化妝品與洗滌劑產品的重要成分［17］，尤其是脂肪酶的去污作用最強，很多的洗滌劑產品通常選擇添加脂肪酶。

試驗以高濃度的植物皂素提取液為發酵基質，優化枯草芽孢桿菌CICC 23083 和地衣芽孢桿菌CICC 21085 發酵表達脂肪酶、蛋白酶和果膠酶，提高植物皂素液的去污力與洗滌效果，開發一款可降解、溫和的富酶天然表面活性劑，為制備天然可降解的化妝品與洗滌劑產品提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 CICC 23083 購于商城北納創聯生物科技有限公司，CICC 21085 購于中國工業微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 供試藥劑及其他化合物 橄欖油購于麥克林公司；聚乙烯醇（AR）、酚酞購于成都市科龍化工試劑廠；三氯乙酸、磷酸二氫鉀、十二水磷酸氫二鈉、氫氧化鈉（AR）購于天津市大茂化學試劑廠；福林酚、酪蛋白、DNS 試劑、果膠購于索萊寶生物科技有限公司；蛋白胨（AR）、95%乙醇（AR）、瓊脂粉購于國藥集團化學試劑有限公司；牛肉膏購于北京奧博里生物技術有限責任公司；茶皂素粉購于陜西承乾生物科技有限公司。

1.1.3 供試培養基 蛋白胨5.0 g/L，牛肉浸出物3.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，調pH 7.0，固體培養基另加20 g/L瓊脂粉。

1.1.4 儀器 立式蒸汽壓力滅菌柜（YXQ-LS-50SII），上海博訊實業有限公司醫療設備廠；恒溫培養箱（LRH-250-S），韶關市泰宏醫療器械有限公司；數顯恒溫水浴鍋（HH-4），國華電器有限公司；紫外分光光度計（759S），上海儀電分析儀器有限公司；超凈平臺（VS-840K-U），蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；分析天平（BSA224S），賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；恒溫定時攪拌器（JB-3），上海雷磁創益儀器儀表有限公司；羅氏泡沫儀（2151），金壇區白塔安瑞實驗儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 發酵基質的準備 植物皂素提取液的制備參照文獻［18］。在所獲提取液中加入50%茶皂素（皂素濃度為0.48 g/g）攪拌溶解后，調pH 為7，經高壓滅菌鍋121 ℃滅菌15 min 后，放冷即為發酵基質。

1.2.2 粗酶液的制備 取50 mL 發酵基質至250 mL三角瓶，接種5%菌液，在37 ℃，180 r/min 振蕩發酵培養48 h。每隔8 h 取發酵樣液，在4 000 r/min 下離心10 min，取上清液，為粗酶液。

1.2.3 酶活力測定 脂肪酶活力測定方法參照國標GB/T 23535-2009；蛋白酶活力測定方法參照國標GB/T 23527-2009；果膠酶活力測定方法參照文獻［18］。

1.2.4 去污力測定 去污機由勻速攪拌機和恒溫器組成，人工污垢配置方法、去污力測定方法參照國標GB 9985-2009。將去污機接通電源，設置速度為200 r/min，洗滌3 min，溫度設為30 ℃。洗滌液由300 mL 自來水和適量發酵液混勻而成。將潔凈的載玻片（稱重為m0）均勻地鋪上人工污垢，自然晾干（稱重為m1）。將已知涂污量的載玻片夾在勻速攪拌機上，泡入洗滌液中浸泡1 min 后，開啟攪拌機洗滌3 min 后，迅速取出洗后的污片，掛晾3 h 后稱重，為m2。污片重量的損失用以評價發酵液的洗滌性能，分別做3 次平行試驗取平均值。去污力計算公式：Y=（m1-m2）（/m1-m0）×100%。

1.2.5 泡沫高度測定 泡沫高度測定方法參照文獻［19］。

2 結果與分析

2.1 單菌株發酵表達脂肪酶

在前期試驗中，氮源影響（包括酵母膏、蛋白胨和硫酸銨等）的優化試驗結果表明，添加3%酵母膏至發酵基質中，對CICC 21085 表達脂肪酶有顯著的提高作用，最大酶活力到達166.7 U/mL。碳源（蔗糖、葡萄糖、麥芽糖）對脂肪酶表達的影響研究結果表明，蔗糖為最佳碳源。當底物中添加蔗糖濃度為5%，CICC 21085 發酵表達脂肪酶在16 h 獲得最高酶活力，為116.7 U/mL。關于發酵液去污力的對比試驗發現，脂肪酶對去污力的影響顯著大于蛋白酶與果膠酶的混合液。基于前期研究結果，本研究進一步對CICC 23083 單菌株發酵表達蛋白酶與果膠酶，以及CICC 23083 和CICC 21085 雙菌株混合發酵表達蛋白酶、果膠酶和脂肪酶的發酵工藝進行優化。

2.2 單菌株發酵表達蛋白酶與果膠酶

2.2.1 酵母膏的影響 在基質中分別加入1%、3%、5%和7%的酵母膏，每8 h 取樣測定蛋白酶和果膠酶活力，結果如圖1A 所示。在發酵32 h 內，蛋白酶活力不斷增加，酶活力峰值出現在32 h。當酵母膏添加量為3%，蛋白酶活力有最好的表達，在32 h 獲得最大酶活力，為792.6 U/mL。為未添加酵母膏直接發酵最大酶活力（216.8 U/mL）的3.7 倍。當酵母膏濃度進一步增加時，最高蛋白酶活力沒有明顯增加。果膠酶活力同樣在32 h達到峰值（圖1B）。當酵母膏濃度為3%時，最大果膠酶活力為4 352.9 U/mL，約是未添加酵母膏直接發酵最大酶活力（2 140.8 U/mL）的2.0 倍。根據結果推測，在高濃度皂素提取液中添加3%酵母膏即可為枯草芽孢桿菌提供足夠的氮源，滿足該菌生長所需的營養，又可促進蛋白酶和果膠酶的表達。

2.2.2 蔗糖的影響 分別往基質中加入3%、5%、7%和9%的蔗糖用于CICC 23083 發酵表達蛋白酶和果膠酶，每8 h 取樣測定酶活力。從圖2 可以看出，添加5%蔗糖時，蛋白酶活力和果膠酶活力分別在32 h 和16 h 達到最大值237.3 U/mL 和2 283.5 U/mL，分別約為未添加蔗糖直接發酵所獲最大酶活力（分別為 216.8 U/mL 和 2 140.8 U/mL）的 1.1 倍。隨著蔗糖添加量進一步提高至7%～9%，蛋白酶和果膠酶活力提高不明顯。

根據結果分析，對于單菌株CICC 23083 發酵表達蛋白酶與果膠酶，3%酵母膏的促進作用要遠大于5%蔗糖添加量。根據結果推測，高濃度植物皂素提取液可提供充足碳源為CICC 23083 表達雙酶，但額外添加少量外援氮源（3%酵母膏）可顯著促進該菌株表達雙酶。

圖1 酵母膏量對蛋白酶和果膠酶表達的影響

圖2 蔗糖量對蛋白酶和果膠酶表達的影響

2.3 雙菌株混合發酵

圖3 酵母膏量對雙菌株混合發酵產酶的影響

2.3.1 酵母膏的影響 在發酵基質分別加入3%、5%、7%、9%和11%的酵母膏用于CICC 21085 和CICC 23083 混合發酵，每8 h 取樣測定3 種酶活力。從圖3A 可以看出，脂肪酶活力峰值均在16 h 出現。當添加3%的酵母膏可獲得最大脂肪酶活力，為166.7 U/mL，與CICC 21085 單菌株發酵表達脂肪酶所獲最大酶活力相同，說明3%酵母膏添加量對雙菌株混合發酵中的脂肪酶表達影響不明顯。然而添加3%酵母膏發酵，蛋白酶活力在8 h 達到峰值（245.8 U/mL）（圖3B），當酵母膏添加量大于3%時，蛋白酶活力均在發酵24 h 達到酶峰點，最大值為347.9 U/mL。關于果膠酶的表達（圖3C），當發酵基質中添加5%酵母膏時，酶活力在8 h 達到最大值4 745.4 U/mL。添加酵母膏進行雙菌株混合發酵，蛋白酶和果膠酶達到最大酶活力的時間縮短了8～24 h，但兩種酶最大酶活力分別比CICC 23083 單菌株發酵所獲最大酶活力降低了56.1%和提高了9.0%。根據結果推測，雙菌株混合發酵表達三酶時，添加酵母膏對脂肪酶的表達（CICC 21085 發酵）沒有明顯影響，但對蛋白酶和果膠酶的表達量與表達時間（CICC 23083 發酵）都有顯著影響?？紤]到脂肪酶對去污效果影響最大，添加3%酵母膏進行的雙菌株發酵能獲得最大的脂肪酶活力，因此選擇3%酵母膏作為雙菌株發酵的最佳添加量。

2.3.2 蔗糖的影響 在基質添加3%酵母膏基礎上，再分別加入1%、3%、5%和7%的蔗糖進行雙菌株混合發酵，每8 h 取樣測定脂肪酶、蛋白酶和果膠酶活力。如圖4所示，添加7%的蔗糖作為底物發酵時，脂肪酶和蛋白酶分別在24 h 和32 h 獲得最大酶活力，為133.3 U/mL 和327.4 U/mL。果膠酶也在發酵24 h達到活力峰值（圖4C）。當蔗糖添加量為5%時，果膠酶獲得最大酶活力為3 817.7 U/mL；而當蔗糖添加量為7%時，果膠酶活力最大值降低至3 318.2 U/mL。根據結果對比分析發現，與基質中添加3%酵母膏（基質+3%酵母膏）的發酵相比，基質添加3%酵母膏和7%蔗糖（基質+3%酵母膏+7%蔗糖）的發酵所獲最大脂肪酶活力和果膠酶活力分別降低了20.0%和22.5%，而蛋白酶最大活力提高33.2%。

考慮到脂肪酶對產品去污力的影響作用要大于蛋白酶與果膠酶，因此，雙菌株發酵表達三酶的最佳發酵條件為添加3%酵母膏，不需要進一步添加任何碳源。

2.4 洗滌效果比較

如圖5 所示，枯草芽孢桿菌CICC 23083 和地衣芽孢桿菌CICC 21085 單菌株發酵液的相對去污力分別為84.8%和88.9%，比未發酵提取液的去污力（77.4%）分別提高了7.4 和11.5 個百分點。雙菌株混合發酵液去污力最高視為100%，比未發酵皂素提取液去污力提高22.6 個百分點，比單菌株發酵液去污力分別提高11.1、15.2 個百分點。根據結果分析，酶對植物皂素提取液去污力的提升效果大小排序為脂肪酶+蛋白酶+果膠酶>脂肪酶>蛋白酶+果膠酶。研究結果表明，植物皂素提取液作為基質，通過添加3%的酵母膏進行雙菌株混合發酵表達脂肪酶、蛋白酶和果膠酶，即可顯著提升去污力。

圖4 蔗糖量對雙菌株混合發酵產酶的影響

2.5 泡沫高度

泡沫高度是由液膜隔開和并列的氣泡形成的氣泡群，是衡量表面活性劑質量且必須考察的重要性能之一。根據國家標準GB/T 29679-2013 規定，透明與非透明型洗滌類產品的泡沫高度底限分別為100 和50 mm。本研究所獲高濃度皂素提取液（非透明）在發酵前后的泡沫高度基本沒有明顯變化，維持在（157±5）mm，是《化妝品安全技術規范》（2015 版）規定的非透明型產品泡沫高度底限的3 倍多，達到甚至略高于大部分市售透明型洗滌產品的起泡高度。經發酵后的皂素提取液泡沫高度不受影響是因為皂素濃度在發酵過程中沒有變化。

圖5 發酵液洗滌效果對比

3 結論

本研究以高濃度的植物皂素提取液為底物，對CICC 23083 和CICC 21085 發酵表達脂肪酶、蛋白酶和果膠酶的工藝條件進行優化，目的是為了提高皂素提取液的去污能力。結果表明，3%的酵母膏能顯著促進枯草芽孢桿菌CICC 23083 表達蛋白酶和果膠酶，達到的最高酶活力分別是無酵母膏直接發酵的3.7 倍和2.0 倍。蔗糖對單菌株CICC 21085 表達脂肪酶有明顯促進作用，但對單菌株CICC 23083 表達蛋白酶與果膠酶沒有明顯改善作用。利用雙菌株混合發酵時，添加3%酵母膏可獲得最大的脂肪酶活力（166.7 U/mL），但進一步添加7%蔗糖，最大脂肪酶活力和果膠酶活力分別降低20.0%和22.5%，而最大蛋白酶活力提高33.2%。

對發酵液的洗滌性能研究分析發現，雙菌株混合發酵液去污力比未發酵皂素提取液去污力提高22.6個百分點，比單菌株發酵液去污力分別提高11.1～15.2 個百分點。酶對植物皂素提取液去污力的提升效果排序脂肪酶+蛋白酶+果膠酶>脂肪酶>蛋白酶+果膠酶。植物皂素提取液（非透明）在發酵前后的泡沫高度基本沒有明顯變化，維持在（157±5）mm，是國標規定的非透明型產品泡沫高度底限的3 倍多。試驗為開發富酶的天然表面活性劑提供理論依據。