中藥一匹綢總黃酮提取工藝及其含量測定研究

劉 睿，馬秀梅 ，周金艮 ，馬家寶 ，韋麗富 ，陳圣斌 ，趙鳳仙，陳宏夏

（1.南寧市中醫醫院藥學部，南寧 530001；2.廣西中醫藥大學，南寧 530200；3.廣西中醫藥大學第一附屬醫院，南寧 530023；4.廣西壯瑤藥技術研究中心，南寧 530200）

中藥一匹綢屬旋花科，是植物白鶴藤（Argyreia acetaLour.）的莖葉［1，2］，又叫白背絲綢、白牡丹等，具有散癖止血、止咳化痰、消痛解毒、祛風除濕等多種療效。中藥一匹綢可用于醫治風濕疼痛、慢性氣管炎、乳痛等疾病［1，2］。一匹綢主要分布于廣西、廣東、湖南、云南等地區，在臨床上常用做解毒藥［3，4］。黃酮類化合物是廣譜生物活性物質，普遍存在于植物中，具有抗癌、防癌、抑菌、抗病毒、降低膽固醇等藥理作用與生物活性，對內分泌系統［5］和免疫系統等有很好的保護作用［6-9］。

試驗以中藥一匹綢總黃酮含量為指標，采用單因素試驗考察了提取方法、提取溶劑、提取體積、提取時間等因素對提取一匹綢藥材總黃酮含量的影響，再采用正交試驗進一步優選最佳提取工藝，為進一步研究一匹綢藥材的質量標準提供參考依據。目前，國內對一匹綢藥材總黃酮含量測定的相關研究基本屬于空白，為保證其藥材質量及臨床療效，試驗建立一匹綢總黃酮的含量測定方法，為后期開發、利用其藥用資源提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 儀器

XS105D 型十萬分之一天平，梅特勒-托利多稱重設備系統有限公司；UV1780 型紫外-可見分光光度計，島津公司；KQ5200B 型超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司；優普ULUPURE 實驗室超純水儀，上海優普實業有限公司；DFT-1000 型高速萬能打粉機，溫嶺市林大機械有限公司。

1.2 試藥

蘆丁（批號：185126），純度>98%，購于上海融禾醫藥科技有限公司；甲醇、乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等試驗所用試劑均為分析純。藥材采摘于廣西玉林市，經廣西中醫藥大學教授鑒定為一匹綢為旋花科銀背藤屬植物白鶴藤的全草，經55 ℃烘干，備用。

1.3 方法

1.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取105 ℃干燥恒重的蘆丁對照品適量，加70%甲醇溶解，定容至25 mL 容量瓶中，搖勻，制成濃度為0.45 mg/mL 的對照品溶液。

1.3.2 供試品溶液制備 精密稱取一匹綢藥材粉末1.0 g，置錐形瓶中，加入體積分數70%的甲醇25 mL，稱定重量，回流提取1.0 h，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾，精密量取續濾液2.0 mL，置50 mL 容量瓶中，依據總黃酮的測定方法測定其吸光度，用線性方程求出樣品溶液中總黃酮的含量（mg/g），即得一匹綢藥材總黃酮。

1.3.3 單因素試驗 采用單因素試驗考察了提取方法、溶劑體積分數、溶劑體積、提取時間等因素對一匹綢藥材總黃酮提取率的影響。

1.3.4 正交試驗設計 從中藥一匹綢中提取藥材總黃酮的方法主要有有機溶劑提取法。根據查閱的相關文獻，試驗最終采取不同甲醇體積分數為溶劑的提取方法，根據單因素考察結果分析，設置甲醇體積分數（60%、70%、80%）、料液比（1∶30、1∶40、1∶50）、提取時間（1.0、1.5、2.0 h）［10-16］。根據正交設計助手軟件，選用L（934）正交試驗設計（表1）。

2 結果與分析

2.1 檢測波長的選擇

精密量取上述對照品溶液3 mL 于25 mL 容量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，靜置6 min 加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，靜置6 min，再加4%氫氧化鈉溶液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置12 min，以相應試劑作空白，在400～800 nm 測定吸收光譜，其最大吸收波長為512 nm（圖1）。

表1 正交試驗因素與水平

圖1 蘆丁對照品吸收光譜

2.2 線性方程的制定

分別取“1.3.1”對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 mL 于25 mL 容量瓶中，加5%亞硝酸鈉0.4 mL，放置6 min后，加10%硝酸鋁0.4 mL，放置6 min，再加4%的氫氧化鈉4 mL，加水至刻度，搖勻，放置10 min，然后在 512 nm 測定［10］。以吸光度對濃度做線性方程，方程為y=13.045x-0.039 2，R2=0.999 2，在0.009～0.072 mg/mL 與吸光度有良好的線性關系。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 精密稱取一匹綢藥材粉末約1.0 g，按“1.3.2”操作制備供試品，于 512 nm 波長處連續6 次測定吸光度，結果RSD為1.21%，小于3%，表明該方法精密度良好。

2.3.2 穩定性試驗 精密稱取一匹綢藥材粉末約1.0 g，按“1.3.2”操作制備供試品，于512 nm 波長處分別在0、10、20、30、40、50、60 min測定吸光度，RSD值為2.75%，小于3%，表明吸光度在60 min 內基本穩定。

2.3.3 重復性試驗 精密稱取壯藥一匹綢藥材粉末樣品6 份，每份約1.0 g，按“1.3.2”操作制備供試品，于512 nm 波長處平行測定其吸光度，計算一匹綢藥材總黃酮的平均含量為24.85 mg/g；RSD值為2.79%，小于3%，表明該方法重復性良好。

2.3.4 加樣回收率試驗 取同一批次已知總黃酮含量的一匹綢藥材粉末（含量為24.85 mg/g）0.5 g，精密稱定，共9 份，分成3 組，即低、中、高加樣組（0.5 g 藥材總黃酮含量的80%、100%和120%加樣，精密加入蘆丁對照品，加樣量分別為9.94、12.43、14.91 mg），按“1.3.2”操作制備供試品，于512 nm 波長處平行測定其吸光度，計算總黃酮的含量。由表2 可知，一匹綢低、中、高加樣組的總黃酮平均回收率分別為98.90%、100.07%、101.02%，RSD值分別為 2.12%、2.74%、2.51%（n=3），表明該方法準確性良好。

表2 加樣回收率試驗（n=3）

2.4 單因素考察試驗結果

2.4.1 提取方法考察 取一匹綢藥材粉末約1.0 g，置錐形瓶中，提取時間1 h、提取體積25 mL、70%甲醇提取，分別采用浸漬法、超聲提取法和回流提取法對藥材進行總黃酮提取，按“1.3.2”操作制備供試品。由圖2 可知，回流提取法的提取率最高。

圖2 提取方法對總黃酮提取率的影響

2.4.2 甲醇體積分數考察 取藥材粉末約1.0 g，置錐形瓶中，以提取時間1 h、25 mL 不同體積分數的甲醇溶劑為提取條件，采用回流提取法，做單因素試驗，甲醇體積分數分別為30%、50%、60%、70%、80%和100%，按“1.3.2”操作制備供試品。由圖3 可知，70%甲醇回流提取總黃酮提取率最高。

圖3 甲醇體積分數對總黃酮提取率的影

2.4.3 提取時間考察 取藥材粉末約1.0 g，置錐形瓶中，以70%甲醇25 mL 為提取條件，采用回流提取法，以提取時間對藥材總黃酮提取率做單因素試驗，提取時間分別為 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，按“1.3.2”操作制備供試品。由圖4 可知，提取時間為1.5 h 提取率最高。

圖4 提取時間對總黃酮提取率的影響

2.4.4 溶劑體積考察 取藥材粉末約1.0 g，置錐形瓶中，以提取時間1 h、70%甲醇為提取條件，采用回流提取法，以不同體積70%甲醇對藥材總黃酮提取率做單因素試驗，70%甲醇提取體積為分別20、30、40、50、60、70 mL，按“1.3.2”操作制備供試品。由圖5 可知，溶劑體積為50 mL 時提取率最高。

2.5 正交試驗結果

根據正交設計助手軟件，正交試驗及方差分析結果見表3、表4。由表3、表4 可知，甲醇體積分數和料液比對一匹綢總黃酮的提取有顯著影響，而提取時間對一匹綢總黃酮的提取無顯著性影響；方差分析表明，甲醇體積分數和料液比兩個因素都具有顯著差異，而提取時間無顯著差異，且各影響因素的強弱為料液比（B）>甲醇體積分數（A）>提取時間（C），所以對一匹綢提取效果有統計學意義的因素是甲醇體積分數和料液比，考慮試驗效率、試驗時間以及成本，選擇提取時間為1.0 h，因此最理想的提取方案是A2B2C1，即甲醇體積分數為70%，料液比是1∶40，回流提取時間是1.0 h。

圖5 溶劑體積對總黃酮提取率的影響

表3 正交試驗結果

表4 正交試驗方差分析

2.6 樣品含量測定

精密稱取一匹綢藥材粉末3 份，每份約1.0 g，置錐形瓶中，按“1.3.2”操作制備供試品，按正交試驗最佳提取方案測定總黃酮的含量，結果見表5。

表5 一匹綢藥材總黃酮含量測定結果

3 討論

試驗以一匹綢藥材為研究對象，考察了甲醇體積分數、溶劑提取體積和提取時間3 個影響因素，一匹綢總黃酮的提取采用回流提取法，利用正交試驗來優選一匹綢總黃酮的最佳提取工藝。結果表明，藥材一匹綢的最佳提取工藝為回流提取，70%甲醇，料液比1∶40，提取 1.0 h 效果最佳。

在單因素試驗的基礎上，通過正交試驗，建立了一匹綢總黃酮提取的工藝優化。方差分析具有顯著性，各因子對總黃酮提取率影響依次為料液比>甲醇體積分數>提取時間。