地耳草總黃酮提取工藝優化與含量測定

吳 冰，莫婷婷，陸梅元，曾 超，趙鳳仙

（1.柳州市中醫醫院，廣西 柳州 545001；2.廣西中醫藥大學第一附屬醫院，南寧 530023；3.廣西壯族自治區食品藥品審評查驗中心，南寧 530029）

地耳草是藤黃科金絲桃屬地耳草（Hypericum ja?ponicumThumb.）的全草，具有保護肝臟、提高免疫、抗腫瘤等功效［1，2］。地耳草腫瘤抑制作用是其重要的研究方向，其提取物對前列腺癌、結腸癌細胞以及白血病有抑制作用［3］。地耳草主要含有黃酮類、間苯三酚衍生物和吡喃酮類化學成分［2，4，5］。

現代研究表明［6-8］，黃酮類化合物具有抗氧化、清除自由基、降血脂改善心肌供血等作用［9］，還具有抗腫瘤、抗心血管疾病、抗感染和抗病毒等藥理作用［10-12］。目前，國內對地耳草總黃酮含量測定的相關研究較少，為保證其藥材質量及臨床療效，本試驗建立了地耳草總黃酮的含量測定方法，為建立地耳草藥材的質量標準提供科學依據。研究將同時對12 批不同產地的地耳草進行總黃酮含量測定，為地耳草藥材的質量評價提供一定的參考價值，也為研究地耳草藥材的質量控制新方法奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試藥

蘆丁（批號：195106），純度>98%，購于上海融禾醫藥科技有限公司；其余試驗所用試劑均為分析純。藥材來源見表1，經廣西中醫藥大學第一附屬醫院藥學部副主任中藥師曾超鑒定為藤黃科金絲桃屬地耳草的全草，經54 ℃烘干，備用。

表1 不同產地地耳草樣品的來源

1.2 儀器

UV1780 型紫外-可見分光光度計，島津公司；XS105D 十萬分之一天平，梅特勒-托利多稱重設備系統有限公司；KQ5200B 超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司；DFT-1000 高速萬能打粉機，溫嶺市林大機械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取105 ℃干燥至恒重的蘆丁對照品6.32 mg，加65%乙醇溶解，定容至25 mL 容量瓶中，搖勻，制成濃度為0.252 8 mg/mL的對照品溶液。

1.3.2 供試品溶液制備 取藥材粉末約1.0 g，精密稱定，置錐形瓶中，加75%乙醇30 mL 稱定重量，回流提取0.5 h，再稱定重量，用65%乙醇補足減失的重量，搖勻，過濾，精密量取續濾液1 mL 置25 mL 容量瓶中，即得供試品溶液。

1.3.3 線性方程的制定 分別取對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 mL 于 10 mL 容量瓶中，加5%亞硝酸鈉0.4 mL，放置6 min 后，加10%硝酸鋁0.4 mL，放置6 min，再加4%氫氧化鈉4 mL，加水至刻度，搖勻，放置10 min，然后在510 nm 測定吸光度［13］。

1.3.4 單因素試驗 分別考察提取方法、乙醇體積分數、提取體積、提取時間對總黃酮提取率的影響。

1.3.5 正交試驗設計 地耳草中提取總黃酮的方法主要有有機溶劑提取法。根據查閱的相關文獻和《中國藥典》2015 年版［14，15］，試驗最終采取乙醇為溶劑進行提取，根據單因素考察結果分析，設置乙醇體積分數（65%、75%、85%）、料液比（1∶20、1∶30、1∶40）（g/mL）、提取時間（0.5、1.0、1.5）設計L9（34）正交試驗（表2），使用紫外-可見分光光度計測定地耳草總黃酮含量。

表2 L9（34）正交試驗因素與水平

2 結果與分析

2.1 線性方程

以吸光度對濃度做線性方程，方程為y=8.697 2x-0.006 5，R2=0.999 2，在 0.012 6～0.101 1 mg/mL 濃度與吸光度有良好的線性關系。

2.2 方法學考察

2.2.1 精密度試驗 精密稱取廣西富川縣產的地耳草藥材粉末約1.0 g 制備供試品溶液，于510 nm 波長處連續6 次測定其吸光度，結果RSD為1.02%，表明該方法精密度良好。

2.2.2 穩定性試驗 精密稱取廣西富川縣產的地耳草藥材粉末約1.0 g 制備供試品溶液，于510 nm 波長處分別在0、20、40、60、80、100、120 min 測定吸光度，計算藥材的RSD值為2.15%，表明吸光度在120 min內基本不變，樣品在120 min 內穩定。

2.2.3 重復性試驗 精密稱取廣西富川縣產的地耳草藥材樣品6 份，每份藥材粉末約1.0 g 制備供試品溶液，于510 nm 波長處平行測定其吸光度，計算地耳草藥材的平均含量為31.28 mg/g，RSD值為2.56%，表明該方法重復性良好。

2.2.4 加樣回收率試驗 稱取地耳草莖藥材粉末6份，每份約0.5 g，精密稱定，精密加入蘆丁對照品溶液15.64 mg 制備供試品溶液，于510 nm 波長處平行測定其吸光度，計算總黃酮的含量（表3）。由表3 可知，平均回收率為99.61%，RSD值為2.43%（n=6），表明該方法回收率良好。

表3 加樣回收率試驗（n=6）

2.3 單因素考察

2.3.1 提取方法的考察 取廣西富川縣的地耳草藥材粉末約1.0 g，精密稱定，置錐形瓶中，提取時間1 h、30 mL、65%乙醇為提取條件，分別采用超聲提取法、回流提取法和浸漬法對藥材進行總黃酮提取。結果表明，回流提取法的提取率最高，故而選擇回流提取（圖1）。

圖1 提取方法對總黃酮提取率的影響

2.3.2 乙醇體積分數的考察 取藥材粉末約1.0 g，精密稱定，置錐形瓶中，采用回流提取法提取時間1 h，以30 mL 35%、45%、55%、65%、75%和85%乙醇對藥材總黃酮提取率做單因素試驗，結果表明，75%乙醇回流提取地耳草藥材總黃酮的提取率最高（圖2）。

圖2 乙醇體積分數對總黃酮提取率的影響

2.3.3 提取體積的考察 取藥材粉末約1.0 g，精密稱定，置錐形瓶中，采用回流提取法提取時間1 h，以 10、20、30、40、50 和 60 mL 75% 乙醇對藥材總黃酮提取率做單因素試驗，結果表明，提取體積為30 mL 的提取率最高（圖3）。

圖3 提取體積對總黃酮提取率的影響

2.3.4 提取時間考察 取藥材粉末約1.0 g，精密稱定，置錐形瓶中，采用回流提取法以75%乙醇30 mL，考察提取時間為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h 對藥材總黃酮提取率的影響，結果表明，提取時間為1.0 h 的提取率最高（圖4）。

圖4 提取時間對總黃酮提取率的影響

2.4 正交試驗結果

根據正交設計助手軟件、試驗方差分析結果可知，乙醇體積分數對總黃酮的提取工藝有顯著性影響，而提取體積和提取時間無顯著性差異，且各影響因素的強弱為乙醇體積分數（A）>料液比（B）>提取時間（C），對地耳草總黃酮含量有統計學意義的因素是乙醇體積分數，提取體積和提取時間沒有顯著性意義，因此最理想的提取方案是A2B2C2，即75%乙醇、料液比1∶30、回流提取1.0 h 提取效果最佳（圖5）。

2.5 樣品含量測定

精密稱取每個產地的地耳草藥材粉末3 份，每份約1.0 g，置錐形瓶中制備供試品溶液，測定總黃酮含量，結果見表6。

表4 正交試驗結果

表5 正交試驗方差分析

表6 不同產地的地耳草藥材總黃酮含量測定結果

3 小結與討論

試驗以地耳草為研究對象，考察了乙醇體積分數、提取體積和提取時間3 個影響因素，采用回流提取法，利用正交試驗方法來優選地耳草總黃酮的最佳提取工藝，確定影響地耳草總黃酮提取工藝的主要因素是溶劑體積分數、提取體積和提取時間等。地耳草的最佳提取工藝為回流提取，乙醇體積分數為75%，料液比1∶30，提取1.0 h。

在相同試驗條件下，加入同體積、同體積分數的乙醇可能會出現提取率不一致的狀況。具體原因可能是由于地耳草藥材粉末接觸乙醇的溶劑面積不一樣。但是在加入相同質量地耳草的情況下，加入乙醇的量越多，提取率越高，呈正相關關系。除此之外，還可以考察更多的因素，如提取溫度、提取溶劑、溶劑pH 和提取次數等，且每個因素也可以通過單因素試驗確定更好的試驗水平，再通過正交試驗優選出提取率更佳的方案。

不同產地地耳草中總黃酮含量差異較大，廣西富川縣產的地耳草總黃酮含量最高，其次是廣西賀州市和廣西昭平縣，而廣西合浦縣和廣西北海市產的地耳草總黃酮含量較低。可能是由于不同地域、不同氣候、不同土壤以及不同的采摘季節影響而產生的結果。

地耳草自然資源豐富，在臨床中應用廣泛。通過查閱相關文獻發現，目前對地耳草總黃酮的研究還較少，為保障其臨床用藥合理、安全、有效，本研究通過正交試驗篩選出地耳草總黃酮的最佳提取工藝，為進一步研究、開發地耳草的藥用資源提供科學依據。