頭花杜鵑葉中精油成分及其抑菌活性研究

紀(jì)若薇，楊 揚(yáng)，林鵬程

（青海民族大學(xué)藥學(xué)院/青海省青藏高原植物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/青海省藥物分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810007）

頭花杜鵑（Rhododendron capitatum）系杜鵑花科杜鵑屬植物，是中國(guó)西北地區(qū)杜鵑屬中分布較廣的一個(gè)種，產(chǎn)于青海、甘肅、四川、西藏等地［1］。藏醫(yī)常以其花、葉入藥，性溫，味辛，治培根病、肺部疾病等［2］。研究發(fā)現(xiàn)頭花杜鵑精油具有明顯的祛痰、鎮(zhèn)咳作用［3］。馬萍等［4］利用GC-MS 對(duì)頭花杜鵑精油成分進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)主要成分為蒎烯、丁酮、月桂烯、石竹烯等。頭花杜鵑在青海省蘊(yùn)藏量豐富，為進(jìn)一步開發(fā)利用該資源，對(duì)入藥部位葉中精油的抑菌活性和不同季節(jié)其精油成分的差異進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

頭花杜鵑于2018 年采于青海省互助北山林場(chǎng)，由青海民族大學(xué)藥學(xué)院林鵬程教授鑒定。活性測(cè)試菌種均購于中國(guó)藥品生物制品檢定所，具體見表1。

正構(gòu)烷烴系列化合物（C7～C30）購自上海安譜科學(xué)儀器有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；營(yíng)養(yǎng)瓊脂購自北京化學(xué)試劑公司；蛋白胨購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；牛肉膏購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；氯化鈉購自天津市紅巖化學(xué)試劑廠。

Agilent 7890/5975C-GC/MS 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)安捷倫公司；AL244 型分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；HZQ-X100A 型恒溫振蕩培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；GZX-9076MBE 型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；AS-1060L 型高壓滅菌鍋，鄺杏生物技術(shù)有限公司；SW-CJ-2FD 型潔凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司。

表1 供試菌種總匯

1.2 方法

1.2.1 精油成分的提取 取新鮮頭花杜鵑的葉粉碎，參照《中華人民共和國(guó)藥典》（2015 年版），用水蒸氣蒸餾法提取精油，用1 g 無水硫酸鈉干燥，再取上層清液作為精油供試液。

1.2.2 GC-MS 分析條件

1）色譜條件。色譜柱為HP-5 彈性石英毛細(xì)管柱（30 m×250 μm×0.25 μm）；按設(shè)定程序升溫；載氣He；載氣流量2 mL/min；汽化室溫度220 ℃；進(jìn)樣量0.4 μL；分流比20∶1。用于頂空直接進(jìn)樣的程序升溫條件：初始溫度40 ℃，保持2 min，以6 ℃/min 升至80 ℃，保持 1 min，再以 5 ℃/min 升至160 ℃，保持 1 min 最后以10 ℃/min 升至290 ℃，保持 6 min。

2）質(zhì)譜條件。離子源EI；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；傳輸線溫度200 ℃；數(shù)據(jù)采集全掃描；質(zhì)量范圍50～500 amu。

1.2.3 保留指數(shù)（KI）測(cè)定 精密移取正構(gòu)烷烴混合對(duì)照品，頂空進(jìn)樣分析，用于計(jì)算精油各組分的KI值；分別測(cè)定各個(gè)條件下正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間。根據(jù)保留指數(shù)公式計(jì)算各組分的KI值，KI= 100n+100(tx-tn)/(tn+1-tn)，其中tx、tn和tn+1分別為被分析組分和碳原子數(shù)為n和n+1的正烷烴(tn

1.2.4 菌種活化 接種藤黃微球菌、大腸埃希氏桿菌、金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、乙型副傷寒沙門菌等細(xì)菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中或營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，30～35 ℃培養(yǎng)18～24 h。接種白色念球菌和黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基上，23～28 ℃培養(yǎng)3～5 d。

1.2.5 菌懸液的制備 將上述細(xì)菌培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成濃度為108cfu/mL 的菌懸液。將上述真菌培養(yǎng)物加入3～5 mL 含0.05%（V/V）聚山梨酯80 的0.9%無菌氯化鈉溶液，孢子洗脫后，用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用無菌的含0.05%（V/V）聚山梨酯80 的0.9%氯化鈉溶液配制成濃度為108cfu/mL 的孢子懸液。

1.2.6 抑菌圈的測(cè)定 采用濾紙片瓊脂平板擴(kuò)散法，對(duì)頭花杜鵑葉精油抑菌圈的直徑進(jìn)行測(cè)定。用移液槍從已制備好的待試菌懸液中吸取0.2 mL，加入到200 mL 的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或馬丁氏培養(yǎng)基中，混合均勻。將混合好的帶有菌懸液的培養(yǎng)基依次倒入培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)基凝固。用移液槍分別吸取3、5、7 和 10 μL 精油，噴灑在已滅菌、直徑為 6 mm 的圓形濾紙片上，用已滅菌的鑷子將浸有不同濃度的精油濾紙片貼在同一培養(yǎng)基上。將貼好的培養(yǎng)基倒置在培養(yǎng)箱中，細(xì)菌30 ℃培養(yǎng)18～24 h，真菌25 ℃培養(yǎng)24～48 h 后測(cè)量抑菌圈的直徑。每個(gè)菌種做5 次平行試驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 頭花杜鵑葉精油的顏色及出油率

分別提取1、6、10 月采得的頭花杜鵑葉精油，所得提取物均為淡黃色，出油率分別為0.25%、0.32%、0.30%。

2.2 頭花杜鵑葉精油成分分析

對(duì)頭花杜鵑葉精油成分進(jìn)行GC-MS 分析，按峰面積歸一化法計(jì)算求得各化學(xué)成分的峰面積相對(duì)百分含量。通過MSD 化學(xué)工作站檢索NIST08 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫，對(duì)照各成分保留指數(shù)，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)解析［5-11］，確定所測(cè)樣品中精油的化學(xué)成分（表2）。

從表2 可看出，6 月的精油含量最多，為80.42%，其 次 為 10 月 和 1 月 ，分 別 為 71.11% 和74.17%。1 月份的精油鑒定出化合物最多，達(dá)82 種，但各物質(zhì)的含量相對(duì)偏小，含量最高的僅有21.33%。6 月和10 月的精油主成分相似，都以α-蒎烯和β-蒎烯為主，共同物質(zhì)達(dá)17 種。1 月的精油成分與這兩個(gè)月份有很大的差異，前者多以脂肪族化合物為主，后者多以萜類化合物為主。表明不同時(shí)間采得的頭花杜鵑，其葉精油成分及含量具有很大差異。

表2 頭花杜鵑精油化學(xué)成分

續(xù)表2

2.3 不同濃度頭花杜鵑葉精油的抑菌活性

通過統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)不同濃度揮發(fā)油的抑菌活性進(jìn)行方差分析，結(jié)果P>0.05，表示水平差異不顯著，即同種植物不同濃度的揮發(fā)油對(duì)同一菌種的抑制作用差異不明顯。可能與試驗(yàn)中濃度梯度變化較小有關(guān)，故研究揮發(fā)油對(duì)不同菌種的抑菌活性時(shí)，選取10 μL 進(jìn)行比較。

2.4 頭花杜鵑葉精油對(duì)不同菌種的抑菌活性

結(jié)果表明，頭花杜鵑葉精油對(duì)銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉和大腸埃希氏桿菌沒有抑制作用，對(duì)其他5 個(gè)菌種都有明顯的抑制作用，其抑菌活性為藤黃微球菌>金黃色葡萄球菌>乙型溶血性鏈球菌>枯草芽孢桿菌>乙型副傷寒沙門菌。

表3 精油對(duì)菌種的抑菌活性

3 小結(jié)

采集了青海省互助北山不同月份的頭花杜鵑，采用水蒸氣蒸餾法提取葉中精油，采用頂空進(jìn)樣的方式，利用GC-MS技術(shù)分析頭花杜鵑葉精油的成分，結(jié)果顯示，頭花杜鵑葉精油的組成隨月份的不同差異較大，其中6 月的精油含量最多，1 月的精油化合物種類最多。

通過濾紙片法對(duì)頭花杜鵑葉精油進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，結(jié)果表明，不同濃度的精油對(duì)同一菌種的抑制作用不具有顯著性差異，該精油對(duì)金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、乙型副傷寒沙門菌、乙型溶血性鏈球菌和枯草芽孢桿菌具有抑制作用，其中，對(duì)藤黃微球菌的抑菌活性最強(qiáng)，該結(jié)論或可對(duì)頭花杜鵑葉精油的抑菌作用研究提供理論支持。