一種瑤浴散劑質量標準的試驗研究

李金洲，陳子雋，劉玟君，盧惠敏，林玉港，魏江存，陳 勇

（1.廣西中醫藥大學藥學院，南寧 530022；2.廣西中醫藥大學科學實驗中心，南寧 530022；3.廣西國際壯醫醫院壯瑤藥研發中心，南寧 530022）

瑤族人民生活在山高林密、氣候濕熱的崇山峻嶺之中，這里常年高溫多雨，毒蟲遍地，瘟瘴盛行［1］。在長期的生活實踐中，瑤族人民總結出了一套集養生、保健、祛病于一體的瑤族醫藥文化，瑤浴就是瑤族醫藥的杰出代表之一。瑤浴具有祛風除濕、活血化瘀、排汗解毒等功效。由于瑤浴的獨特功效，其與芬蘭的桑拿浴、土耳其的蒸汽浴共同被譽為世界上優秀的三大沐浴文化。2008 年6 月，瑤浴被列入第二批國家非物質文化保護遺產名錄［2］。目前市面上瑤浴產品琳瑯滿目，瑤浴養生館的數目也在逐年增多，可見瑤浴這種養生方式越來越受到人們的青睞。

但是，尚缺乏標準對瑤浴產品進行相關的質量控制，對于單個瑤浴產品的質量控制研究也比較少見。目前國內對瑤浴及瑤浴產品質量標準的研究還十分欠缺，瑤浴的保護與傳承還有很多工作要做［3］。為發揚、推廣瑤浴的使用，保障其使用安全，本試驗研究了取自瑤族聚居地——廣西壯族自治區金秀瑤族自治縣的一種民間常用瑤浴粉，該瑤浴粉具有安神助眠的作用，在當地具有較高的知名度，其主要以合歡皮、石菖蒲、雞血藤、茯神、三七葉、樟樹、刺五加、柚子葉、玫瑰花等產自廣西金秀圣塘山的天然藥材組成。試驗觀察瑤藥粉末顯微性狀和顯微鑒別特征，并對其進行薄層鑒別檢查；按2015 版《中華人民共和國藥典》（四部）通則中的方法對藥粉進行水分、灰分、酸不溶性灰分及浸出物含量進行測定［4］；采用HPLC 法測定藥粉中β-細辛醚的含量。以期對該瑤浴粉進行質量控制，并為其他瑤浴產品的質量控制提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

圣塘山瑤浴粉（生產批號180312、180414、180512、180616、180712、180812、180912、181014、181016、181116），β-細辛醚對照品（生產批號RQA579，純度≥98%，畢得醫藥）；合歡皮陰性對照樣品（自制），雞血藤陰性對照樣品（自制），石菖蒲陰性對照樣品（自制），合歡皮（20190601）、雞血藤（20190501）、石菖蒲（20190501）對照藥材均購自廣西仙茱中藥有限公司，并經廣西中醫藥大學藥用植物學教研室郭敏副教授鑒定，確定為豆科植物合歡（Albizia julibrissinDurazz.）的干燥樹皮、豆科植物密花豆（Spatholobus suberectusDunn）的干燥藤莖、天南星科植物石菖蒲（Acorus tatarinowiiSchott）的干燥根莖。

Waters e2695 高效液相色譜儀，PhenomenexC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）柱；徠卡DM2500 光學生物顯微鏡、DFC500 圖像分析系統，德國萊卡儀器公司；電子天平，梅特勒-托利多儀器；電熱鼓風干燥箱、馬弗爐，上海實驗儀器廠有限公司；SX2-4-10 電熱恒溫水浴鍋，上海齊欣科學儀器有限公司；硅膠G 薄層板，青島海洋化工廠。甲醇為色譜純；其余試劑均為分析純；水為純凈水。

1.2 方法

1.2.1 常規項目檢查 水分測定按2015 版《中華人民共和國藥典》［4］（四部）“0832 水分測定法”中的烘干法，浸出物測定按2015 版《中華人民共和國藥典》（四部）“2201 浸出物測定法”熱浸法，因考慮到瑤浴粉的使用方式，在浸出物測定法中只進行了熱浸法，總灰分測定和酸不溶性灰分按2015 版《中華人民共和國藥典》（四部）“2302 灰分測定法”。

1.2.2 制片方法 將瑤浴散劑粉碎后，過80 目篩，取適量，用水合氯醛溶液透化后稀甘油裝片，將裝片置顯微鏡下觀察、測量、拍照。

1.2.3 色譜條件 Phenomenex C1（8250 mm×4.6 mm，5 μm）柱，流動相甲醇-0.1%磷酸（65∶35），柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，檢測波長257 nm，進樣量10 μL。

1.2.4 對照品溶液的制備 精密稱取β-細辛醚對照品24.75 mg，用純甲醇溶解并定容至50 mL 容量瓶中，制得約0.495 mg/mL β-細辛醚對照品溶液，微孔濾膜過濾，備用。

1.2.5 供試品溶液的制備 取瑤浴粉末0.50 g 置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇20 mL，密塞稱定重量，浸泡1 h，超聲處理（功率250 W、頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻濾過，取續濾液即得［5］。

1.2.6 陰性對照溶液的制備 取缺石菖蒲樣品0.50 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，按照“1.2.5”方法制備陰性對照溶液。

2 結果與分析

2.1 常規項目檢查

水分、浸出物、總灰分和酸不溶性灰分測定結果見表1。

2.2 顯微鑒別

由圖1 可知，粉末中有類圓形或長條形的石細胞，壁厚，孔溝明顯，纖維成束，周圍細胞含有草酸鈣方晶，形成晶纖維，符合2015 版《中華人民共和國藥典》中記載的合歡皮的典型顯微特征。

圖1 瑤浴散劑中合歡皮的顯微特征

由圖2 可見，粉末中具有明顯的具緣紋孔導管，其中還含有黃棕色物質。紅棕色塊遍布視野，該特征符合2015 版《中華人民共和國藥典》中記載的雞血藤的顯微特征。

圖2 瑤浴粉中雞血藤的顯微特征

由圖3 可知，粉末中可見多角形草酸鈣方晶、類圓形分泌細胞，細胞內充滿著紅棕色分泌物，該特征符合2015 版《中華人民共和國藥典》中記載的石菖蒲的典型顯微特征。

圖3 瑤浴粉中石菖蒲的顯微特征

2.3 TLC 定性鑒別

2.3.1 瑤浴粉與合歡皮薄層鑒別 取瑤浴粉2.0 g，加入50%甲醇40 mL，浸泡1 h，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水5 mL 溶解，用正丁醇振搖提取2 次，每次5 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇0.5 mL溶解，得到試品溶液。取合歡皮對照藥材1.0 g，同法制成對照藥材溶液；另取缺合歡皮陰性樣品，同法制成陰性對照溶液。按照2015 年版《中華人民共和國藥典》（四部）通則0502 進行試驗，分別吸取上述3 種溶液各2 μL，點于同一硅膠G 薄層板上，以石油醚-乙酸乙酯（2∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴10%三氯化鋁溶液加熱顯色，置于紫外燈（365 nm）下檢視（圖4）。由圖4 可知，供試品色譜在與對照藥材相應位置上顯相同顏色的熒光斑點，且陰性對照處無斑點干擾。

圖4 合歡皮TLC 色譜

2.3.2 瑤浴散劑與雞血藤薄層鑒別 取瑤浴粉2.0 g，加入20 mL 乙醇超聲提取30 min，過濾，濾液蒸干，加5 mL 水溶解，用5 mL 乙酸乙酯萃取2 次，揮干乙酸乙酯，殘渣加甲醇溶解，得到供試品溶液。取雞血藤對照藥材1.0 g，同法制成對照藥材溶液；另取缺雞血藤陰性樣品2.0 g，同法制成陰性對照溶液。按照2015 年版《中華人民共和國藥典》（四部）通則0502 進行試驗，分別吸取上述3 種溶液各 2 μL，點于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-甲醇（30∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置于紫外燈（254 nm）下檢視（圖5）。由圖5 可知，供試品色譜在與對照藥材相應位置上顯相同顏色的熒光斑點，可見陰性對照無斑點干擾。

圖5 雞血藤TLC 色譜

2.4 系統適用性試驗

取上述對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各適量，按“1.2.3”色譜條件進樣測定，記錄色譜（圖6）。由圖6 可知，理論塔板數按β-細辛醚峰計不低于3 000，分離度均大于1.5，其他成分對測定無干擾。

圖6 高效液相色譜

2.4.1 線性關系考察 取對照品溶液 1、2、3、4、5 mL 置于10 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得質量濃度分別為 49.5、99.0、148.5、198.0、247.5 μg/mL 的標準溶液，取適量進樣測定，記錄色譜圖。以β-細辛醚質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得β-細辛醚的回歸方程為Y=4.73×104X-7.85×105，（n=5，R=0.999 9），結果表明，β-細辛醚在質量濃度為 49.5～247.5 μg/mL 呈現良好的線性關系（圖7）。

圖7 β-細辛醚標準曲線

2.4.2 定量限與檢測限考察 取對照品溶液適量，倍比稀釋，進樣量為10 μL，以信噪比10∶1、3∶1 分別測定定量限、檢測限。結果表明，β-細辛醚的定量限為0.92 ng，檢測限為0.31 ng。

2.4.3 精密度試驗 取對照品溶液適量，按色譜條件重復進樣測定6 次，每次10 μL，記錄β-細辛醚的峰面積并計算RSD值。結果表明，β-細辛醚峰面積的RSD為0.26%，說明儀器精密度良好。

2.4.4 穩定性試驗 取供試品溶液（批號180312）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、10、12 h，然后按色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果表明，β-細辛醚峰面積的RSD為0.98%，說明供試品溶液于室溫下放置12 h 內基本穩定。

2.4.5 重復性試驗 取瑤浴散劑樣品適量（批號180312），按色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按回歸方程計算樣品中β-細辛醚的含量。結果表明，β-細辛醚的平均含量為0.073 2%，RSD為0.98%（n=6），說明該方法重復性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗 取已知含量的瑤浴散劑樣品（180312）適量，共6 份，精密稱定，分別加入一定量的β-細辛醚對照品，制備供試品溶液，再按色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表2。

2.4.7 耐用性試驗 精密稱取瑤浴散劑樣品（180312）適量，制備供試品溶液，再按色譜條件進樣測定，考察不同色譜柱（Thermo Acclaim120 C18、Fei?niGen RedClassicalⅡ C18、Phenomenex Gemini C18），流速（0.5、0.8、1.0 mL/min）、柱溫（25、30、35 ℃）對樣品含量測定結果的影響，結果見表3。結果表明，當色譜柱、流速和柱溫發生一定程度變化時，能滿足測試要求，方法耐用性良好。

表2 加樣回收率試驗結果（n=6）

表3 耐用性試驗結果

2.5 樣品含量測定

取10 批瑤浴散劑樣品各適量，制備供試品溶液，再按色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按回歸方程計算樣品含量，結果見表4。由表4 可知，不同批次的瑤浴粉中β-細辛醚含量在0.071%～0.085%，各批次大致相同，且RSD符合2015 版《中華人民共和國藥典》中的要求。故建議以不低于均值80%設限，即該瑤浴粉中β-細辛醚含量不得低于0.064%。

表4 樣品含量測定結果

3 討論

石菖蒲具有鎮靜、抗癲癇、抗抑郁、抗疲勞、抗氧化等藥理作用，與本瑤浴粉的主要功效一致，故選用石菖蒲中主要化學成分作為含量測定的指標成分［6，7］。石菖蒲中 α-細辛醚和 β-細辛醚是 2 種主要的揮發油成分，故在試驗過程中對石菖蒲中的α-細辛醚進行了含量測定，與β-細辛醚相比含量更低，因此最后選用β-細辛醚作為瑤浴粉中的指標成分［8］。合歡皮具有解郁安神的功效，用于心神不安。查閱2015 版《中國藥典》（一部）發現，合歡皮含量測定的指標性成分（-）-丁香樹脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷，但在試驗中發現，該成分在瑤浴粉中含量太低，難以檢測［9］。雞血藤是一味具有補血活血、舒筋活絡的藥材，該作用與瑤浴粉的保健養生功效基本一致，故選擇雞血藤和合歡皮進行薄層色譜鑒別。在進行薄層色譜鑒別時，按照2015 版《中華人民共和國藥典》（一部）中合歡皮和雞血藤的薄層展開條件進行展開，發現并不能取得較好的展開效果，只能重新對薄層展開條件進行摸索。查閱文獻，發現樟木［10］、三七葉［11］、柚子葉［12］、玫瑰花［13］中均含有黃酮類化合物，且結構相似，陰性干擾嚴重。故最后確定選用雞血藤和合歡皮進行薄層定性，且這兩味藥也是瑤浴散劑中的主要成分，符合中藥復方質量控制的相關規定［14］。

試驗初步建立了廣西壯族自治區金秀瑤族自治縣瑤族人民常用的一種瑤浴散劑的質量標準，還有許多需要完善的地方，有待進一步的試驗研究。希望通過該試驗能給瑤浴產品的質量控制研究提供一定的參考依據和研究思路，建立瑤浴產品的初步質量標準來對市面上常見的瑤浴產品進行控制，確保瑤浴產品的安全性、有效性和可控性。