把天門化學成分預試驗及其總黃酮含量測定

張 瑩，傅 靜，王孝勛，鐘秋節，俞 鵬

（廣西中醫藥大學藥學院，南寧 530200）

把天門為豆科胡枝子屬植物美麗胡枝子（Les?pedeza formosa）的根，又名三妹木、謀見亮［1］，廣泛分布于廣西、廣東、陜西、江蘇、甘肅、浙江、安徽、江西、湖北、福建、臺灣、四川、貴州、云南等省區［2］。廣西主產于柳州、梧州、桂林、南寧等地，是瑤族地區的民間常用藥［1］。中醫認為其味微辛澀，性微溫，具有活血散瘀、消腫止痛之功，主治跌打腫痛、風濕骨痛、肺癰［3］。瑤醫認為把天門具有清熱涼血、活血散瘀、消腫止痛、利尿、止血、潤肺、祛風濕的功效；主要用于風濕骨痛、關節痛、腰腿痛、跌打損傷、骨折、脫臼等癥［1］。目前國內外學者對美麗胡枝子化學成分的研究較少，僅有Li 等［4］從安徽產美麗胡枝子根皮中分離得到2 個新的黃酮類成分，命名為Lespedezaflava?none F和Lespedezaflavanone G。吳和珍等［5］研究發現湖北產美麗胡枝子的根皮中含有槲皮苷。傅靜等［6］建立了廣西產美麗胡枝子莖葉的HPLC 指紋圖譜，采用對照品指認了3 個黃酮類成分，分別為夏佛塔苷、牡荊素及異牡荊素。現代藥理試驗表明，黃酮類化合物具有抗炎鎮痛、抗腫瘤、抗心律失常、抗心肌缺血、降壓等作用［7］，療效顯著。本試驗首次采用系統預試驗法對把天門的化學成分進行較全面的研究，建立其總黃酮含量測定的方法，為其活性成分的開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

把天門藥材于2018 年4 月至2019 年8 月采自廣西壯族自治區不同市縣，共10 批，經廣西中醫藥大學韋松基教授鑒定為豆科胡枝子屬植物美麗胡枝子的根，標本存于廣西壯瑤藥重點實驗室，樣品信息見表1。蘆丁對照品，中國食品藥品檢定研究院，批號：100080-201811；95%乙醇、石油醚（60～90 ℃）、氯仿、醋酐、氨水、鹽酸、濃硫酸、氫氧化鉀、氫氧化鈉、碘化鉍鉀、α-萘酚、茚三酮、三氯化鐵、鎂粉、磷鉬酸、冰乙酸等均為分析純，水為去離子水，其余試劑自制。

1.2 儀器

HH-6 數顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司；BP211D 型電子分析天平，德國賽多利斯公司；ZF-20C 型暗箱三用紫外分析儀，上海精密儀器儀表有限公司；RS-232 精密電子天平，丹納赫西特傳感工業控制天津有限公司；UV-2600 紫外可見分光光度計，島津儀器蘇州有限公司。

表1 把天門樣品信息

1.3 方法

1.3.1 化學成分預試驗

1）水供試液的制備。取把天門藥材粉末10 g，置于250 mL 錐形瓶中，加去離子水100 mL，室溫浸泡24 h，過濾出約20 mL 濾液檢測氨基酸、多肽、蛋白質。將剩余的冷水浸泡液連同殘渣置于60 ℃左右水浴加熱30 min，趁熱過濾，濾液檢測糖、多糖、有機酸、皂苷、苷類、酚類、鞣質［8］。

2）乙醇供試液、酸水供試液的制備。稱取把天門藥材粉末10 g，置于250 mL 錐形瓶中，加95%乙醇100 mL，水浴加熱回流1 h，稍冷后加入去離子水使其含醇量為70%。冷卻至室溫，過濾，濾液分成2份，一份濾液濃縮成膏狀，加5%鹽酸5 mL 使溶解，過濾，酸水溶液用于生物堿的定性檢測。另一份濾液用于黃酮、酚類、蒽醌、內酯、香豆素、強心苷、萜類、甾體、有機酸、酚類等化合物的定性檢測［8］。

3）石油醚供試液的制備。取把天門藥材粉末1 g，置于50 mL 錐形瓶中，加石油醚（60～90 ℃）10 mL，室溫浸泡3 h，過濾，濾液用于油脂、揮發油檢測［8］。

1.3.2 總黃酮含量測定

1）對照品溶液的制備。精密稱取120 ℃干燥至恒重的蘆丁對照品10 mg，置于50 mL 容量瓶中，加70%乙醇定容，搖勻，即得濃度為0.200 mg/mL 的蘆丁對照品溶液。

2）供試品溶液的制備。取把天門藥材粉末約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇20 mL，稱重，回流提取60 min，冷卻至室溫，稱重，用相應溶劑補足減失的重量，過濾，濾液即為供試品溶液。

3）測定方法。精密移取供試品溶液1 mL，置于100 mL 容量瓶中，加1%三氯化鋁溶液1 mL，加去離子水定容，搖勻，放置20 min，以相應溶劑為空白，于波長275 nm 處測定吸光度。

2 結果與分析

2.1 系統性試驗

2.1.1 線性關系考察 精密吸取蘆丁對照品溶液（0.200 mg/mL）0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，按確定的顯色條件顯色，以相應溶劑為對照，于275 nm 波長處測定吸光度。以對照品溶液的吸光度為縱坐標、濃度為橫坐標，繪制標準曲線。計算得到回歸方程為Y=35.142 2X+0.040 645 3，r=0.999 6，表明蘆丁在 0.004～0.040 mg/mL 呈良好的線性關系。

2.1.2 精密度試驗 精密量取供試品溶液（BTM-2）1 mL，置于100 mL 容量瓶中，按確定的測定方法測定吸光度，重復測定6 次，記錄供試品溶液的吸光度，RSD為0.06%，說明儀器精密度良好。

2.1.3 穩定性試驗 精密量取供試品溶液（BTM-2）1 mL，置于100 mL 容量瓶中，按確定的測定方法每隔10 min 進行1 次吸光度測定，記錄120 min 內供試品溶液的吸光度，RSD為1.06%，表明供試品溶液在120 min 內穩定。

2.1.4 重復性試驗 取同一批（BTM-2）藥材粉末0.5 g，平行6份，制備供試品溶液，分別取供試品溶液1 mL，置于100 mL容量瓶中，按確定的測定方法測定吸光度，記錄供試品溶液的吸光度，計算把天門總黃酮的含量，RSD為0.15%，說明該方法重復性良好。

2.1.5 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的藥材（BTM-2）粉末6 份，各0.25 g，分別加入蘆丁對照品15.965 0 mg，制備供試品溶液。移取供試品溶液1 mL，置于100 mL 容量瓶中，按確定的測定方法測定吸光度，計算總黃酮含量，結果平均加樣回收率為95.29%，RSD為0.65%（表2）。

2.2 化學成分預試驗

水提取液檢測結果顯示，把天門含有糖、多糖、苷類、有機酸、酚類、鞣質類，可能含有皂苷，不含氨基酸、多肽、蛋白質（表3）。乙醇提取液檢測結果表明，把天門含有有機酸、酚類、鞣質類、黃酮類、蒽醌類，可能含有強心苷，不含生物堿、植物甾醇、三萜類、內酯、香豆素（表4）。石油醚提取液檢測結果顯示，把天門不含揮發油及油脂類，結果見表5。

2.3 總黃酮含量測定

取10 批次把天門藥材樣品，制備供試品溶液，按確定的方法測定供試品溶液的吸光度，計算把天門總黃酮的含量，結果見表6。

3 小結與討論

化學成分預試驗表明，本品可能含有黃酮、糖、多糖、苷類、有機酸、酚類、鞣質、蒽醌等成分類型。總黃酮含量測定試驗中比較了直接測定法［9］、硝酸鋁比色法和三氯化鋁比色法3 種方法。結果表明，硝酸鋁比色法中，供試品溶液加入4%氫氧化鈉溶液立即出現絮狀沉淀，與胡文波等［10］研究時發現的現象相同，且對照品和供試品溶液的最大吸收波長相差甚遠；三氯化鋁比色法測定時，溶液澄清且穩定性好，供試品溶液與蘆丁對照品溶液在275 nm 左右有最大吸收，故選擇三氯化鋁比色法為總黃酮含量測定的顯色方法。考察了三氯化鋁顯色劑的濃度、用量、顯色時間等因素，最終確定顯色方法為1%AlCl3乙醇溶液1 mL，加水定容，搖勻，放置20 min；通過單因素及正交試驗確定最佳的提取工藝為取把天門樣品0.5 g，加70%乙醇20 mL，提取60 min。結果表明，蘆丁對照品溶液濃度在0.004～0.040 mg/mL呈良好的線性關系，回歸方程為Y=35.142 2X+0.040 645 3（r=0.999 6），10 批把天門藥材中總黃酮含量在31.84～75.85 mg/g。試驗確定了瑤藥材把天門含有的化學成分，為進一步研究其活性成分及開發利用提供了依據。

表2 加樣回收率試驗結果（n=6）

表3 水提取液預試結果

表4 乙醇提取液預試結果

表5 石油醚提取液預試結果

表6 10 批次把天門藥材總黃酮含量測定結果（X±SD，n=3）