番茄葉片及果實總RNA 提取方法的比較

郭荔雯 ，擺福紅 ，沙曉東 ，張風琴 ，王 林，王曉敏 ，2，3，4

（1.寧夏大學農學院，銀川 750021；2.寧夏設施園藝（寧夏大學）技術創新中心，銀川 750021；3.寧夏優勢特色作物現代分子育種重點實驗室，銀川 750021；4.寧夏現代設施園藝工程技術研究中心，銀川 750021）

番茄（Solanum lycopersicum）屬茄科一年生或多年生草本植物，是現代分子生物學研究中的一種重要模式植物［1］。在番茄分子生物學研究時，需從番茄葉片和果實中提取純度高、完整性好的RNA，但由于其組織中積累了大量的次生代謝物質，如蛋白質、多糖和多酚等物質易與RNA 共沉淀，對RNA 的提取和純化有干擾作用，進一步影響總RNA 的產量和質量［2］。目前，番茄總RNA 的提取方法有CTAB法、異硫氰酸胍法、Trizol 法及試劑盒法等，不同提取方法對于同一組織材料提取的差異較大［3，4］，因此對于植物不同組織或同一組織不同時期的總RNA 提取方法的比較顯得尤為重要。

本研究以番茄品種Money maker（MM）為材料，分別采用Trizol 法、Trizol 改良法和試劑盒法（提葉片用OMEGA 試劑盒，提果實用華越洋試劑盒）共3 種方法分別提取番茄葉片和不同時期果實的總RNA，從RNA 濃度、純度、完整性、成本等方面篩選出提取番茄葉片和果實總RNA 的最佳方法，以期為后續相關基因的表達及功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為MM，種植于寧夏大學北校區溫室，進行常規化管理，葉片于五葉期進行采樣，果實在青果期、轉色期以及成熟期分別采樣，液氮速凍后于-80 ℃冰箱保存備用。

1.2 方法

葉片和不同時期果實總RNA 提取的試劑盒法分別為OMEGA 試劑盒與華越洋試劑盒。

1.2.1 OMEGA 試劑盒法 操作參照植物RNA 提取試劑盒（美國OMEGA 公司）的說明書進行。

1.2.2 Trizol法 操作參照馬敬等［5］的方法進行。

1.2.3 Trizol 改良法 操作參照譚麗麗等［1］的方法，不同之處在于取0.1 g 番茄葉片液氮研磨成細粉后加0.1 g PVP（聚乙烯吡咯烷酮）繼續研磨，液氮揮發后，迅速加入Trizol 試劑，在RNA 沉淀前再加入等量的苯酚∶氯仿∶異戊醇（PCI）=25∶24∶1，重新抽提1次。試驗過程中加入的試劑都需預冷。

1.2.4 華越洋試劑盒法 操作參照華越洋（北京華越洋）試劑盒的說明書進行。

1.3 總RNA 質量檢測

取2 μL RNA 溶液，利用核酸蛋白檢測儀檢測RNA 樣品濃度和OD值。一般情況下，RNA 樣品的OD260/OD280比值低于1.8 證明有蛋白質和酚類等雜質的污染；而高于2.0 證明有異硫氰酸殘留等或RNA有一定降解，所以純度較高的RNA其OD260/OD280值 應 在 1.80～2.00。 RNA 的OD260/OD230值 應 大 于2.00，若小于2.00 表明樣品被小分子物質或有機溶劑污染［6，7］。

用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的完整性：取5 μL RNA 樣品，點樣于1%瓊脂糖凝膠（每100 mL凝膠含有 10 μL GelRed）點樣孔中，140 V 恒壓電泳15 min，在凝膠成像儀下觀察并照相記錄。瓊脂糖凝膠電泳主要用來檢測RNA 的完整性，總RNA 樣品的主要成分是28S rRNA、18S rRNA、5S rRNA；從電泳結果的28S rRNA 和18S rRNA 的完整性來判斷RNA 樣品有無降解以及降解程度［7］。完整性好的RNA 經瓊脂糖凝膠電泳后，其28S rRNA 與18S rRNA 條帶的亮度比例約為2∶1。若發生部分降解，一方面28S rRNA 會降解為18S rRNA，導致二者比例的改變；另一方面28S rRNA 與18S rRNA 降解為更小的片段，導致RNA 條帶拖尾；若發生徹底降解，則RNA 在泳道內呈彌散狀，無任何條帶。

2 結果與分析

2.1 不同方法提取番茄葉片總RNA 的純度及濃度的比較

由表1可知，Trizol法、Trizol改良法和OMEGA試劑盒法3種方法提取的番茄葉片總RNA的OD260/OD280分別為 1.92、1.97 和 1.99，均在 1.80～2.00，說明 3 種方法提取的RNA 均未受DNA、蛋白質和酚類物質的污染；且3 種方法的OD260/OD230均大于或等于2.00，說明3 種方法提取的RNA 基本未受小分子物質和鹽類污染，表明3 種方法提取的番茄葉片總RNA 純度均符合基本要求。從濃度分析可得，OMEGA 試劑盒法提取的總RNA 濃度最高，為2 560 ng/μL，Trizol 改良法和 Trizol 法次之，分別為 2 096、2 080 ng/μL。因此，對于番茄葉片，3 種方法提取的RNA純度與濃度都能達到后續分子生物學研究的需求。

表1 3 種方法提取番茄葉片總RNA 的純度及濃度比較

2.2 不同方法提取番茄葉片總RNA 凝膠電泳檢測

經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果（圖1）顯示，3種方法提取的番茄葉片總RNA 均有28S rRNA、18S rRNA和5S rRNA 3 個條帶，且泳道內均無明顯彌散拖尾現象，表明其基本不存在降解。OMEGA 試劑盒法提取的番茄葉片總RNA 的28S rRNA 和18S rRNA 兩條帶亮度比值約為1∶1，表明其完整性一般；Trizol改良法提取的28S rRNA 和18S rRNA 亮度比值近似為2∶1，完整性最好；Trizol 法的條帶清晰度較其他2種方法差，28S rRNA 和18S rRNA 亮度比值約為1∶1。綜上所述，Trizol 改良法提取效果比OMEGA試劑盒法提取的RNA 更好。

圖1 3 種方法提取番茄葉片總RNA 瓊脂糖凝膠電泳檢測

2.3 不同方法提取番茄果實總RNA純度及濃度比較

由表2可知，對于青果期的番茄果實，華越洋試劑盒法和Trizol改良法提取的果實總RNA的OD260/OD280均在 1.80～2.00，而 Trizol 法OD260/OD280小于 1.80，說明受到少量DNA、蛋白質和酚類物質的污染。但華越洋試劑盒提取的果實總RNAOD260/OD230大于2.00，表明其純度最好。其他2 種方法OD260/OD230低于1.00，說明受到大量小分子物質和鹽類的嚴重污染，導致二者純度均較差。Trizol 法提取的RNA 濃度最低（271 ng/μL），Trizol 改良法與華越洋試劑盒法提取的RNA 濃度相當，后者略高（317 ng/μL）。

對于轉色期的番茄果實，華越洋試劑盒法提取的番茄果實總RNA 的OD260/OD280和OD260/OD230分別為1.98和2.24；其他2種方法OD260/OD280均小于1.80，說明RNA 受到少量DNA、蛋白質和酚類物質的污染，OD260/OD230略低于2.00，說明受到少量小分子物質和鹽類的污染。3 種方法所提取的RNA 濃度相當，依次為351、362、377 ng/μL。

對于成熟期的番茄果實，華越洋試劑盒法和Trizol 改良法所提取總RNA 的OD260/OD280分別為1.92和1.91，OD260/OD230分別為2.11和2.03，說明兩者純度均較高，而Trizol法OD260/OD280為1.70，OD260/OD230為1.38，說明該方法提取的RNA 受各種雜質污染比較嚴重。3 種方法所提取的RNA 濃度相當，分別為328、332、348 ng/μL。

表2 3 種方法提取番茄果實總RNA 的純度及濃度比較

2.4 不同方法提取果實總RNA 凝膠電泳檢測

2.4.1 青果期番茄果實總RNA 凝膠電泳檢測 3 種方法提取的青果期果實總RNA 樣品經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果表明，華越洋試劑盒法和Trizol 法提取的總RNA 有明顯的28S rRNA 和18S rRNA 條帶，且無彌散，二者亮度比值均為1∶1，完整性較好。而Trizol 改良法提取的總RNA 條帶不夠清晰，無明顯的28S rRNA 和18S rRNA 條帶，且有彌散，表明完整性差。綜合而言，華越洋試劑盒法對番茄青果期總RNA 的提取效果最好（圖2）。

圖2 3 種方法提取青果期番茄果實總RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測

2.4.2 轉色期番茄果實總RNA 凝膠電泳檢測 3 種方法提取的轉色期果實總RNA 樣本經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果表明，Trizol 法提取的總RNA 的28S rRNA 和18S rRNA 條帶不清晰，說明存在嚴重的降解；而Trizol 改良法、華越洋試劑盒法提取的總RNA條帶較清晰，28S rRNA 和18S rRNA 條帶亮度比值均接近于2∶1，說明RNA 的完整性好。所以，Trizol改良法和華越洋試劑盒法對轉色期番茄總RNA 的提取效果均好（圖3）。

圖3 3 種方法提取轉色期番茄果實總RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測

2.4.3 成熟期番茄果實總RNA 凝膠電泳檢測 3 種方法提取成熟期果實總RNA 經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果表明，華越洋試劑盒法和Trizol 改良法提取的總RNA 均有明顯的28S rRNA 和18S rRNA 條帶，Trizol 改良法的 28S rRNA 和 18S rRNA 條帶亮度比值接近于2∶1，說明該方法提取的成熟期番茄果實RNA 的完整性較好；Trizol 法提取的總RNA 28S rRNA 和18S rRNA 條帶不明顯，存在大量降解，完整性差。綜合而言，Trizol 改良法適合成熟期番茄果實總RNA 的提取（圖4）。

圖4 3 種方法提取成熟期番茄果實總RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測

2.5 耗時與成本比較

通過對番茄葉片和不同時期果實總RNA 提取成本和耗時比較可知（表3），試劑盒法耗時最短（40 min），但成本較高（17.2 元/個、14.8 元/個）；Trizol 改良法成本次之（5.5 元/個），但耗時最長（75 min）；Trizol 法成本最低（4.8 元/個），耗時較長（65 min）。說明試劑盒法具有高效的提取特點，能快速地從番茄葉片及果實中提取到較高質量的RNA，且提取過程操作簡單。Trizol改良法成本低，耗時長，提取效果較好，Trizol法成本雖然最低，但是提取的效果較差。

表3 RNA 提取方法成本與成本的比較

3 討論

完整性好、純度高的RNA 在基因克隆及表達分析等分子生物學研究中發揮著至關重要的作用［8］。目前已有多種植物RNA 提取分離的報道，但不同植物其組織成分不同，適用的有效提取方法也不同，同一植物組織的RNA 提取效果也有明顯差異［9］，尤其是番茄果實中含有多糖、多酚和蛋白質等物質，如何去除這些物質對番茄果實提取到有效的RNA 有一定的影響［10］。

在試驗中，對于番茄葉片總RNA 的提取而言，3種方法均適用，其中OMEGA 試劑盒法所提取的總RNA 濃度最高，但電泳條帶中28S rRNA 和18S rRNA 的亮度沒有明顯的 2∶1 比例，而 Trizol 改良法提取的總RNA 的濃度次之，但電泳條帶中28S rRNA和18S rRNA 的亮度比值約為2∶1，完整性最好。分析造成上述問題的原因可能是在操作過程中對雜質的去除不夠徹底，也有可能是在瓊脂糖凝膠電泳時RNA 有所降解，所以提取番茄葉片總RNA 效果最好的是Trizol改良法。

對于青果期及轉色期果實總RNA 的提取而言，華越洋試劑盒法提取總RNA 的效果最好，純度和濃度均最高，但成本也最高。雖然Trizol 改良法所提取的轉色期果實總RNA 凝膠電泳條帶的28S rRNA與 18S rRNA 亮度比值約為 2∶1，但是OD260/OD280為1.72，低于1.80，說明純度不夠好，RNA 受到較多的DNA、蛋白質和酚類物質的污染。對于成熟期果實而言，華越洋試劑盒法提取效果最好，但成本最高；而Trizol 改良法的提取效果次之，但成本低，若在考慮成本的基礎上，Trizol 改良法更適于提取成熟期果實的RNA。其中，試劑盒法的提取操作較簡單，耗時短，但成本最高（提取番茄葉片的為OMEGA 試劑盒，提取番茄果實的為華越洋試劑盒）；Trizol 改良法較Trizol 法而言，Trizol 改良法的所有操作均需在冰盒上進行，且操作步驟較多，耗時更長。除此之外，不同時期果實用同種方法提取出RNA 的效果也有所不同，分析可能是由于不同時期的番茄果實中多糖、多酚及蛋白質等物質的含量有所不同，尤其是成熟期的果實多糖及多酚的含量更高，而上述物質易與RNA 共沉淀，對RNA 的提取和純化有干擾作用，進一步影響總RNA 的產量和質量。因此，即使目前有關提取RNA 方法的報道很多，但對特定的植物組織而言，需根據具體情況做適當的調整，盡可能地減少RNase對核酸的干擾，進而保證提取RNA的效果。

綜合來看，試劑盒法最適宜于番茄青果期果實及轉色期果實高質量RNA 的提取，Trizol 改良法最適宜于番茄葉片及成熟期果實高質量RNA 的提取，為后續的基因克隆、mRNA 表達分析、cDNA 文庫建立及原位雜交等分子生物學試驗奠定了基礎。