檀香小G蛋白Rac1基因的克隆與功能分析

卞 展， 劉小金，洪 舟， 張寧南，孟 森， 徐大平

(中國林業科學研究院 熱帶林業研究所，國家林業和草原局熱帶林業研究重點實驗室，廣州 510520)

檀香(SantalumalbumL.)為檀香科(Santalaceae)檀香屬半寄生小喬木，主要分布于印度、印尼和澳洲等地區[1]。檀香心材含有獨特香氣，主要用于高檔家具制造。同時，從檀香心材提取出的精油是高級化妝品和醫藥行業的重要原料。檀香是檀香屬中經濟價值最高的珍貴用材樹種[1-3]。全世界檀香的年需求量估計在1萬噸以上，而年產量只能滿足約四分之一，市場供需矛盾十分突出，價格日益昂貴。然而在巨大經濟利益驅動下，過度開發和非法貿易導致檀香野生自然資源破壞殆盡，瀕臨滅絕[4]。

檀香是一種半寄生植物，其葉片具有正常的光合作用能力，但其部分根系必須通過特化的寄生器官——吸器侵入鄰近植物根系上，通過木質部融合連接，從寄主體內攝取生長所需要的水分和營養[5]。選擇一種適宜的寄主植物會直接影響檀香各培育階段的成活率和生長狀況，這對于檀香人工栽培來說至關重要，而吸器的形成及能否成功侵入寄主植物是檀香人工造林成敗的關鍵。吸器是寄生植物與寄主植物建立水分和養分傳遞的通道，但吸器發育的誘導因子和發育過程十分復雜。許多特定的化學物質如苯醌類、香草酸、松柏醇及激素(細胞分裂素、生長素)均能誘導寄生植物吸器的形成[4-13]。研究表明，醌還原酶QR1通過催化 2,6-二甲氧基對苯醌(DMBQ)及其衍生物產生活性氧(ROS，reactive oxygen species)，可以誘導吸器形成[6-8]。這些吸器誘導因子(haustorium-inducing factors，HIFs)可能通過啟動信號轉導級聯，導致寄生植物根中活性氧的積累進而誘導吸器的形成[9-14]。但是到目前為止，寄生植物獨特的吸器發育過程仍舊缺乏系統研究，其分子機理十分欠缺。

植物Rac蛋白家族屬于低分子量GTP結合蛋白ROP家族，根據其C端保守基序和轉錄后修飾，分為Rac Ⅰ和Rac Ⅱ兩個亞家族[15]。兩類Rac蛋白廣泛參與側根發育、花粉管極性生長、次生細胞壁合成及細胞程序性死亡等信號途徑的調控，因此又被稱為“分子開關”[15-17]。Rac分子開關的功能狀態主要取決于結合GTP或GDP的狀態：當與GTP結合時處于激活狀態，有功能活性；當與GDP結合時，處于失活狀態，無功能活性[17]。目前研究普遍認為Rac蛋白是通過互作激活呼吸爆發氧化酶蛋白(Rboh)，進而產生ROS信號介導調控各種生理途徑[15,18-19]。前期研究中發現檀香SaRboh蛋白受到吸器誘導因子DMBQ的顯著誘導，且SaRboh蛋白產生的ROS信號是檀香吸器發育所必需，但Rac蛋白是否也參與了檀香吸器的形成過程仍不清楚。

本研究以檀香為材料，對檀香SaRac1基因進行了克隆及生物信息學分析，并對其亞細胞定位、組織表達特性、對吸器誘導因子響應等進行了分析，為探究SaRac1基因調控ROS信號并介導檀香吸器發育的功能奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材 料

供試檀香(SantalumalbumLinn.)材料為本實驗室保存，種植于中國林業科學研究院熱帶林業研究所(廣州，23°11′N, 113°23′E)。取幼葉、成熟葉、老葉、莖、根、吸器6個組織樣品，每個組織3個生物學重復，凍存于-80 ℃冰箱。

基因克隆所用大腸桿菌DH5α、pSuper載體為林木遺傳與育種國家重點實驗室保存。反轉錄試劑盒、高保真酶、熒光定量試劑盒購自天根公司。RNA快速提取試劑盒購自Omega 公司。pEASY無縫克隆試劑盒購自北京全式金公司。

1.2 方 法

1.2.1 總RNA提取、cDNA合成與基因克隆cDNA根據植物RNA提取試劑盒(Omega，R6834-01)操作說明書，提取檀香總RNA。瓊脂糖凝膠和紫外分光度計(Nanodrop 2000，賽默飛公司，美國)檢測RNA質量和濃度。利用天根反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA，根據檀香基因組數據得到的SaRac1基因序列，設計上游引物(5′-ATGAGCGCATCAAGATTCA-3′)和下游引物(5′-TAGTATGGAGCAGGCCTTCTGTACCT-3′)進行PCR擴增，產物純化回收后，一步法無縫連接到pSuper載體，化學轉化至DH5α感受態細胞，經氨芐霉素抗性篩選后，挑取單克隆并進行PCR鑒定及測序。

1.2.2SaRac1基因生物信息學分析SaRac1基因和蛋白序列比對通過Clustal W軟件進行；蛋白質理化性質(分子量、等電點、親水性系數)通過ProtParam 軟件(http://web.expasy.org/protparam/)在線分析[20]。蛋白亞細胞定位利用WoLF PSORT 軟件(http://www.genscript.com/wolf-psort.html)在線預測[21]。SWISS-MODEL同源建模預測其蛋白三級結構[3]。系統進化用MEGA 6.0軟件進行分析繪制[3]。

1.2.3 SaRac1蛋白亞細胞定位將SaRac1無縫連接到pBWA(V)HS載體(35S：SaRac1-GFP融合表達)，參照課題組之前方法制備擬南芥葉片原生質體并瞬時轉化，NLS-mKate 作為核定位marker，采用Leica TCS SP8激光共聚焦顯微鏡觀察SaRac1蛋白定位[22]。

1.2.4SaRac1基因組織表達特異性分析以檀香Actin基因為內參基因(上游：5′-CTCATTTTGCCAGGCCGAAT-3′，下游：5′-CTCTTTACCCAGTACCGGCA-3′)，利用Primer 3.0軟件設計實時熒光定量PCR引物。分別提取檀香幼葉、成熟葉、老葉、莖、根、吸器6個組織RNA并反轉錄為cDNA。以cDNA為模板，實時熒光定量PCR參照SYBR Green Premix Ex Taq Ⅱ Kit(天根生物)說明書進行，設計上游引物(5′-AGGGTTGTGGGATACTGCTG-3′)和下游引物(5′-AAAGCTGGCCTTGCTAATGA-3′)，反應體系為：SYBR Premix 10 μL，上下游引物各1 μL，模板2 μL，dd H2O 6 μL。反應程序：95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共進行45個循環。3次生物學重復，3次技術重復。

1.2.5SaRac1基因對吸器誘導因子的響應分析從中國林業科學院熱帶林業研究所苗圃中選取長勢一致的檀香幼苗(高度10 cm)，采用溫室控制盆栽試驗，將檀香移植于盆中央(泥炭土∶蛭石∶珍珠巖=3∶2∶2，v/v/v)，待檀香幼苗生長相對穩定后，每周澆霍格蘭營養液澆100 mL，持續4周，選擇長勢一致的幼苗，添加10 μmol/L 2, 6-二甲氧基對苯醌(寄生植物吸器誘導因子)為處理，不添加任何物質為空白對照，10 μmol/L 的2, 6-二叔丁基苯醌(DBQ)為陰性對照。以早上8：00為處理的時間起點，分別在處理后0、0.5、1、2、4、8和24 h取根樣品，3個生物學重復，以Actin基因為內參基因，檢測SaRac1基因對各個處理的表達響應，同時統計1個月后的檀香根部吸器數量。每個處理設置3個生物學重復，并進行3個技術重復。采用SPSS20.0進行數據處理和分析。

2 結果與分析

2.1 SaRac1基因克隆

通過設計引物，對SaRac1開放閱讀框進行擴增，經克隆測序得到該基因大小為594 bp，編碼197個氨基酸(圖1)。利用在線分析軟件對蛋白基本理化性質進行預測，發現SaRac1蛋白分子量約21.55kD，理論等電點9.32，親水性系數為-0.083，為親水性蛋白, 不含跨膜結構域和信號肽。通過分析，該蛋白在N端為保守的G結構域，包括：GTP酶活性結構域(G1、G3)、Mg2+離子結合效應區(G2)和GTP結合位點(G4、G5)。其中G2、G3結構域也稱轉換結構域Ⅰ和Ⅱ (switch Ⅰ and Ⅱ loops)，第21位和156位為G結構域保守的半胱氨酸殘基(圖1)。蛋白C端具有CaaL保守基序，其上游具有高度可變的富含堿性氨基酸區域，使蛋白C端形成了可富集正電荷的游離尾部(圖1)。同時檀香SaRac1和擬南芥Rac基因家族進化樹分析表明，SaRac1蛋白和AtRac1～6、AtRac9和AtRac11蛋白同屬于典型且保守的植物Rac Ⅰ 家族蛋白(圖2)。

At. 擬南芥；Os. 水稻；Sa. 檀香圖1 檀香SaRac1蛋白結構域預測結果At. Arabidopsis thaliana；Os. Oryza sativa；Sa. Santalum albumFig.1 Domain prediction of SaRac1

At. 擬南芥；Sa. 檀香圖2 檀香SaRac與擬南芥AtRac蛋白的進化樹分析At. Arabidopsis thaliana；Sa. Santalum albumFig.2 Phylogenetic tree analysis of Rac proteins from Santalum album and Arabidopsis thaliana

2.2 SaRac1蛋白亞細胞定位

通過擬南芥原生質體轉化的方法進一步檢測了SaRac1蛋白的亞細胞定位，以帶有GFP空載體為對照，通過比較SaRac1蛋白融合GFP的載體定位情況，發現SaRac1蛋白主要定位在細胞核和細胞質(圖3)。

2.3 SaRac1基因組織特異性分析

由圖4可知，SaRac1基因在檀香各個組織均有表達，但組織間表達水平差異很大。在根和吸器中表達量最高，幼葉和莖中表達量較高，而在成熟葉和老葉中表達量最低。以成熟葉中SaRac1表達量作為衡量標準，SaRac1基因在根和吸器中表達量分別是成熟葉的8和6.7倍，而幼葉、莖和老葉中表達量分別為成熟葉的2.8、2.6和0.6倍。

不同字母表示處理間差異顯著，P < 0.05，下同圖4 檀香SaRac1基因在不同組織中的相對表達量Different letters represent significant differences among tissues, P < 0.05. The same as belowFig.4 Relative expression level of SaRac1 gene in different tissues of S. album

35S∶GFP表示GFP空載體；SaRac1-GFP表示SaRac1蛋白和GFP蛋白融合表達載體；NLS-mKate表示核定位marker圖3 檀香SaRac1蛋白亞細胞定位35∶GFP was plasmid containing GFP alone; SaRac1-GFP was fusion plasmid; NLS-mKate was used as a nuclear localization markerFig.3 Subcellular localization of SaRac1

圖5 不同處理對檀香SaRac1基因相對表達量和檀香吸器數量影響Fig.5 The relative expression level of SaRac1 gene and haustoria development after treatments

2.4 SaRac1基因對吸器誘導因子的響應分析

采用RT-PCR方法，對吸器誘導因子DMBQ處理不同時間后SaRac1的響應情況進行了分析。與空白對照和DBQ陰性對照相比，SaRac1基因受到吸器誘導因子DMBQ強烈誘導，且在4 h時表達量最高；同時，DMBQ處理顯著促進了檀香吸器發育，其吸器數量分別比空白對照和陰性對照提高55.51%和80.96%(圖5)。

3 討 論

植物Rac蛋白通過與下游不同的蛋白耦合，廣泛參與根毛發育、激素信號轉導、抗逆等生理過程[23]。植物Rac蛋白通常都有GTP酶活性結構域、Mg2+離子結合效應區、GTP結合位點等保守結構域。但這些蛋白的C末端結構差異較大，此結構決定著Rac蛋白在細胞內的定位[19]。一般認為，Rac蛋白一般與質膜耦聯或者游離于細胞質中[23]。檀香Rac1蛋白和其他植物Rac蛋白類似，包含所有的保守結構域，其C末端結構為CSIL[19,23]。本研究采用原生質體進行亞細胞定位試驗發現部分SaRac1蛋白定位在細胞質中，這與之前報道的很多植物Rac蛋白類似[19]。但是意外的是，與之前報道的植物Rac蛋白不同，我們在細胞核中也檢測到了大量的SaRac1蛋白，表明SaRac1蛋白在細胞核內可能也行使著獨特的生物學功能。

為了解SaRac1基因的組織表達模式，本研究通過定量PCR方法檢測檀香6個組織中SaRac1的表達情況。結果表明，SaRac1基因在根和吸器中表達水平較高。一般而言，蛋白在特定組織的表達情況往往與其功能密切相關[24]。SaRac1基因在根和吸器中表達水平較高暗示著該基因可能參與了吸器發育過程。

在水稻中過表達OsRac1基因可產生大量的ROS，且伴隨著大量的抗病基因表達和植保素合成，進而表現出很強的稻瘟病抗性[25]。在擬南芥中，過表達AtRac1基因也可以誘導產生大量ROS，但這種誘導作用可以被NADPH氧化酶抑制劑DPI所抑制，說明DPI可以抑制Rac1依賴的活性氧產生[25-26]。植物Rac蛋白的一個重要功能就是通過調節植物NADPH氧化酶活性進而參與ROS產生[27]。我們的前期研究表明，ROS信號是檀香吸器發育所必需[3]。在本研究中，吸器誘導因子DMBQ顯著促進了檀香吸器發育，同時SaRac1受到吸器誘導因子DMBQ的強烈誘導，這些結果暗示著SaRac1可能通過ROS生成參與了檀香吸器發育過程。在后續研究中，我們將通過遺傳轉化和生化試驗進一步探究SaRac1調控ROS信號生成的機理，并進一步驗證檀香吸器發育是否受該過程的影響。

目前，對寄生植物特有的吸器發育過程而言，分子機理水平研究十分欠缺。SaRac1蛋白受到吸器誘導因子DMBQ的顯著誘導，且與ROS信號密切相關。本研究對該基因進行了克隆、亞細胞定位和表達模式分析，并初步驗證了該基因參與了吸器發育過程，為深入研究SaRac1參與調節ROS信號和吸器發育過程奠定基礎。