陜北黃土高原生物結皮中7種微藻的形態與分子生物學鑒定

祝亞芳，黃興波，程金鳳

(西北農林科技大學 生命科學學院，陜西楊陵 712100)

生物結皮(biological crusts)是在土生藻類拓殖作用下，由微小生物及其代謝產物與沙粒組成[1-3]，是水分、有機物與土壤顆粒緊密結合在土壤表層形成的一種殼狀體[4]，廣泛地分布在干旱半干旱地區，其生物組成主要有藻類、地衣、苔蘚，以及真菌、細菌等[5-6]。其中的藻類是分布在土壤環境中的土生藻類，在生物結皮中占據重要組分[7]。土生藻類能利用自身的固碳、固氮作用增加土壤有機物含量[8-9]，并通過藻體及其分泌物粘固沙粒形成活性生物結皮，從而提高土壤的生物活性[10]，改善土表理化性質，起到抗風蝕的作用?？梢娚锝Y皮中的藻類對固定土壤和促進養分循環具有極其重要的作用。

中國西北部的黃土高原是典型的干旱半干旱生態系統，面臨著水土流失等諸多生態問題。在退耕還林的政策實施后，生物結皮便成為黃土高原典型的地表覆蓋類型，不同降雨量對其蓋度影響較大[11]。其中，李金峰等[12]在該地區發育初期的生物結皮中發現了50種藻類，大多是藍藻和綠藻；楊麗娜等[13]對該地區生物結皮中的藍藻多樣性進行了研究。對于黃土高原生物結皮藻類的研究常見為數量及分布的研究，而利用分子手段對生物結皮藻類群落的系統學研究較少。本研究將對黃土高原生物結皮中的7種純化藻類進行形態學與分子生物學鑒定，并利用MrBayes 3.2.4對這幾種藻類進行系統學分析，為后續黃土高原生物結皮藻類的研究奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及處理

在陜北黃土高原不同區域的每塊樣地上，使用酒精浸泡過的環刀和土鉆采集生長良好的生物結皮樣品(10 cm × 10 cm)。將采集完整的生物結皮除去石塊、植物根系等雜物后，保存到牛皮紙信封內；將所有樣品編號標記，陰干保存帶回實驗室[14]，在超低溫冰箱中保存。各采樣地點見表1。

1.2 結皮藻類的培養與純化

1.2.1 結皮藻類培養選擇合適的錐形瓶并加入80 mL的BG-11[15]培養基后進行滅菌處理、冷卻備用。將室外采集的生物結皮拿到實驗室內，選取發育良好的生物結皮，放入錐形瓶中充分混勻后置于人工氣候培養箱中培養。將光照、光暗周期及溫度參數分別調至40%，10 h / 14 h，26 ℃，培養1周左右，培養期間隨時觀察生長情況，避免生長過旺或雜菌污染嚴重。

表1 陜北黃土高原生物結皮采樣點信息

1.2.2 藻類純化利用水滴稀釋法或平板法[16]對上述培養好的混合藻液進行單藻種純化。首先將平板上長出的單個群落挑出放在倒置顯微鏡下觀察，若形態一致，將其轉入裝有5 mL無菌培養液的小瓶子中培養；若形態不一致，則采用微吸管分離法或稀釋水滴分離法進行純化。整個純化期間定時進行鏡檢，直到觀察到的藻類形態一致為止，即純化完成。最后取對數生長期的藻液滴于載玻片上，制成臨時裝片，在光學顯微鏡下觀察結皮微藻的形態并對其形態特征拍照。

1.3 單藻種的分子鑒定

1.3.1 DNA提取、擴增與測序取對數生長期的藻液，3 000 r/min離心10 min，收集沉淀，稱取少量放到2 mL的離心管中，用CTAB方法進行基因組DNA提取。用于擴增綠藻5.8S+ITS2的引物序列為：正向5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，反向5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′[17]；用于擴增藍藻的16S-23S rDNA的引物為：正向5′-TGTACACACCGGCCCGTC-3′，反向5′-CTCTGTGTGCCTAGGTATCC-3′[18]。PCR反應體系(25 μL)：ddH2O為9.5 μL、2×Taq MasterMix為12.5 μL、正反向引物各1 μL、DNA模板1 μL。擴增完成后，雙向測序由西安擎科生物技術公司完成。

1.3.2 貝葉斯(BI)樹構建測序完成后數據導入軟件Geneious 9.0.2中，進行拼接處理，將處理好的序列提交至GeneBank，利用Blast搜索引擎中的nucleotide blastn下載若干同源序列。然后，對所有序列進行比對、排矩陣后，用jModelTest計算合適模型，最后用MrBayes 3.2.4構建系統發育樹。

1.3.3 遺傳距離分析遺傳距離計算在MEGA 7.0中進行，將剔除外類群序列的上述文件導入MEGA中，并對序列進行分組處理，之后在Distance分析選項中計算遺傳距離三角矩陣，其計算模型選擇K2P。

2 結果與分析

2.1 7株結皮藻的形態特征

本次研究從生物結皮中共純化出7種藻類，其中有5種綠藻(編號分別為SM-2-1、DB-2-1、DB-2-2、SD-1、SD-2)和2種藍藻(編號分別為YJ-3和YJ-2)。

(1)綠藻：SM-2-1細胞為長圓形，兩端具有突出的尖，常見1或2個細胞組成，外有明顯的膠被包裹，細胞長約16.7 μm，色素體片狀周生，胞內有1個明顯的蛋白核(圖1 a，b)。DB-2-1常見為2或4個細胞，由透明膠被包裹聚集，單個細胞為圓球形，直徑約為13.3 μm，色素體呈不規則狀周生，常見1個蛋白核(圖1 c，d)。DB-2-2為球形細胞，胞外有透明的膠被物質，常由數個細胞組成，個體大小差異較大(直徑在15～40 μm間)，色素體均勻分布在藻體細胞內部，有多個蛋白核(圖1 e，f)。SD-1細胞為梭形或紡錘狀且兩端有細長的喙狀末端，整個細胞長約80 μm，兩細長的喙狀末端基本一致，色素體片狀分布在兩端、中間分布較少，具有1個蛋白核(圖1 i，j)。SD-2藻體呈單細胞圓球形，直徑約20 μm，個體間分散生長，色素環狀分布在細胞上，具有蛋白核(圖1 g，h)。

藻類照片均為100倍油鏡下的光學照片(標尺=10 μm)。其中，a、b.SM-2-1； c、d.DB-2-1； e、f.DB-2-2；g、h.SD-2;i、j.SD-1； k～m.YJ-2； n～p.YJ-3圖1 7種結皮藻的形態特征The above photos of algae are optical photos under 100x oil microscope, bar=10 μm. a, b. SM-2-1; c, d. DB-2-1; e, f. DB-2-2; g, h. SD-2; i, j. SD-1; k-m. YJ-2; n-p. YJ-3Fig.1 Morphological characteristics of seven species of biological crust algae

(2)藍藻：YJ-3的藻絲體外側有明顯的鞘，常見鞘內多個藻絲體有規律地纏繞在一起呈束狀，有時鞘內也只出現一個藻絲體，鞘有收縊現象，單個藻絲體寬約8.4 μm，束狀寬約33.3 μm，細胞長寬分別為6.3 μm和3.0 μm，藻體呈藍綠色(圖1，n～p)。YJ-2通常單個藻絲體出現，有時也會多個藻絲相互纏繞出現，細胞間有收縊，細胞長約3.2 μm，寬約1.6 μm，無外鞘，藻體呈藍綠色(圖1，k～m)。

2.2 藻株核酸序列分析

從形態上初步斷定5株編號為SM-2-1、DB-2-1、DB-2-2、SD-1和SD-2的結皮藻為綠藻門植物，進行5.8S+ITS2核酸序列擴增，序列長度分別為664 bp、663 bp、662 bp、589 bp和688 bp，其中GC含量分別為33.43%、49.47%、50.15%、50.76%和51.01%；藻株YJ-3和YJ-2判定為藍藻，16S-23S rDNA序列擴增長度分別為570 bp和465 bp，序列GC含量分別為46.31%和49.03%，圖2為7株結皮藻擴增片段電泳圖。利用Blast搜索引擎中的nucleotide blastn對獲得的5.8S+ITS2序列和16S-23S rDNA序列進行比對，結果顯示如下：

SM-2-1藻株5.8S+ITS2序列與Acutodesmusreginaes CCAP 27666(JQ082326)的比對序列相似度最高(96%)，存在2個堿基差異位點。DB-2-1藻株與多條比對序列相似性均高達100%，無堿基差異。DB-2-2藻株序列與雨生紅球藻H(HaematococcuspluvialisH，GQ463618)序列高度相似(99%)，同時與多種衣藻目(Chlamydomonadales)藻株序列相似(95%左右)。SD-1藻株比對序列與水生境中的環藻科Ankyra屬兩藻株序列[19](HQ219412、HQ219430)只發現一個堿基差異點，相似度高達97%，與Atractomorphaporcatastrain SAG 71.90(KM020065)的5.8S+ITS2序列相似性為91%，存在22個堿基差異位點。SD-2的5.8S+ITS2序列與真眼點藻科(Eustigmataceae)多個藻株序列高度相似，其中與大真眼點藻(EustigmatosmagnusSAG 2370)存在1個堿基差異位點，序列相似性高達99%。藻株YJ-3的16S-23S rDNA序列與NCBI數據庫GeneBank中比對出來的序列相似度都不高，其中序列相似度最高的是偽魚腥藻科(Pseudanabaenaceae)藻株，僅為87%，且有10個位點存在差異。藻株YJ-2的16S-23S rDNA比對序列與細鞘絲藻屬(Leptolyngbya)藻株序列相似度高，其中與Haloleptolyngbyasp. PMC 895.15(MH182758)的比對序列相似度最高(100%)，無堿基差異。

圖2 7株結皮藻DNA擴增片段電泳圖Fig.2 The electrophoresis patterns of DNA amplified fragments of seven species from biological crust algae

2.3 BI樹與遺傳距離分析

2.3.1 結皮綠藻系統樹分析將結皮分離藻株的5.8S+ITS2序列或16S-23S rDNA序列進行同源比對后，下載一些相似性高的序列，通過剪切、排矩陣后，利用MrBayes 3.2.4軟件進行建樹分析。

對結皮綠藻的BI樹(圖3)進行分析可以得出，這5株綠藻可分為4個分支，從上到下分別為柵藻科(Scenedesmaceae)、衣藻目(Chlamydomonadales)、環藻科(Sphaeropleaceae)、真眼點藻科(Eustigmataceae)。其中，DB-2-1和SM-2-1 都屬于柵藻科。DB-2-1與Scotiellopsisreticulate的4個物種聚在一支且支持率為100%，且與這4株藻之間的遺傳距離均為0.000，綜合兩種分析結果得出DB-2-1藻株應該歸于Scotiellopsis屬。SM-2-1與Acutodesmusreginae單獨聚在一起，支持率為64%，兩者間的遺傳距離最小(0.041)，并與NCBI相似性搜索比對結果一致，因此應該歸于尖帶藻屬(Acutodesmus)。SD-1所在的分支為環藻科，與淡水生境的Ankyra屬藻株共為一支，支持率為82%，遺傳距離小于0.057，系統發育樹與遺傳距離分析結果一致，而SD-1形態與Ankyra屬藻種形態極為相似，因此SD-1最有可能是環藻科Ankyra屬物種。SD-2與真眼點藻科真眼點藻屬(Eustigmatos)藻株聚為一支，且與大真眼點藻SAG2370(EustigmatosmagnusSAG2370)的遺傳距離最小0.008，與真眼點藻屬的其他藻種的遺傳距離也都小于0.02，與同源比對結果相結合可確定SD-2最有可能是真眼點藻屬藻種(Eustigmatos)。DB-2-2與一種雨生紅球藻(HaematococcuspluvialisH)和一種土生紅球藻‘Haematococcussp.’(MF482915)聚為一支，支持率為84%，遺傳距離分別為0.005、0.026，通過對DB-2-2的形態觀察以及序列比對分析后，其應歸于紅球藻屬(Haematococcus)。

圖3 5株結皮綠藻5.8S+ITS2的貝葉斯系統發育樹Fig.3 Bayesian phylogenetic tree of 5.8S+ITS2 from five strains of green algae with biological crusts

2.3.2 結皮藍藻系統樹分析對藍藻貝葉斯系統發育樹(圖4)分析顯示，YJ-3和YJ-2聚在一大類分支偽魚腥藻科(Pseudanabaenaceae)中，從BI樹中能明顯的發現這2株藍藻分別歸于不同的屬。YJ-3與偽魚腥藻科(Pseudanabaenaceae)藻株KC525096聚為一支，支持率為100%，兩者間遺傳距離為0.273，遺傳距離值偏大，這與上述NCBI同源序列分析結果一致，因此YJ-3可能為偽魚腥藻科一新物種。YJ-2與細鞘絲藻屬(Leptolyngbya)的2個藻種歸為一個分支，節點支持率為100%，但YJ-2藻絲無鞘，同時遺傳距離較大分別為0.314和0.327，與其序列相似度最高的是Haloleptolyngbyasp.PMC895.15但兩者間的遺傳距離較遠，因此YJ-2也有可能是細鞘絲藻屬(Leptolyngbya)親緣關系較近的一新物種。

圖4 2株結皮藍藻16S-23S rDNA的貝葉斯系統發育樹Fig.4 Bayesian phylogenetic tree of 16S-23S rDNA from two strains of cyanobacteria with biological crusts

3 討 論

目前國內對生物結皮藻類多樣性的研究主要依據其形態學特征來鑒定，該方法較為費時且需要具有多年藻類形態鑒定經驗，但是多數藻類在不同環境及發育階段的形態特征會有所不同，因此僅憑形態學特征來進行藻種鑒定是非常困難的。近年來，藻類分子系統學在其分類、系統發育發生和分子進化等領域得到了廣泛的應用[20-21]，多種DNA保守序列(如16S-23S、ITS等)分析越來越多地用于藻類分子系統研究中[18,22]，確保了鑒定的準確性。本次實驗通過形態觀察并利用5.8S+ITS2和16S-23S rDNA序列分別對純化的結皮綠藻與藍藻完成鑒定，為后續黃土高原生物結皮藻類的研究奠定部分理論基礎。

本研究對7種結皮藻的系統發育分析及形態鑒定可初步確定到屬的水平。在5株結皮綠藻5.8S+ITS2序列比對分析中發現，該序列在多數屬內差異小、非常保守，極易確定到屬。DB-2-1屬于Scotiellopsis屬、SM-2-1屬于尖帶藻屬(Acutodesmus)，均隸屬于柵藻科。柵藻科植物體為真性定性群體，常見多個藻體細胞平行或上下交錯排列、少數藻以單細胞，藻體形態多樣，只有1個周生色素體和一個蛋白核。DB-2-1與Veronika Kaufnerová[23]文中ScotiellopsisreticulateCCALA474的形態一致，無論是從形態還是序列分析都支持DB-2-1是Scotiellopsis屬中的一種。SM-2-1形態符合尖帶藻屬的描述[24]，但是尖帶藻屬胞外無膠被而該藻種胞外存在膠被，很有可能是該屬的新種。DB-2-2與雨生紅球藻 H(HaematococcuspluvialisH)同源性序列最為相似，同時與另外一株紅球藻屬野生藻株(MF482915)聚為一支，因此本文建議DB-2-2歸于紅球藻屬(Haematococcus)。SD-1形態特征較像弓形藻屬(Schroederia)，但系統發育分析與序列比對表明其為Ankyra屬物種，與Yong Jae Kim文中[25]對環藻Ankyrajudayi的形態描述相符，但是兩者生境截然不同，Ankyrajudayi為水生環境而SD-1則是在較為干旱的陜北黃土高原生物結皮中分離的，這與沙漠綠藻起源于淡水藻的推論相吻合。根據分析SD-2可能是真眼點藻屬(Eustigmatos)物種，而真眼點藻是一種單細胞土生藻，具有高產油和可溶性多糖特性，因此基于這兩方面的研究較多，如吳桂秀等[26]。藻株SD-2在生物結皮中分離得到，與真眼點藻屬生境相符，可能對生物結皮的形成和發育起著極其重要的作用。另外2株結皮藍藻中，YJ-3經分子序列分析表明其應歸于偽魚腥藻科，與之歸為一支的偽魚腥藻(KC525096)生境為阿塔卡馬沙漠[27]，生境相同但在序列中存在多個堿基差異且遺傳距離值偏大，其較可能為偽魚腥藻內的一個新種。YJ-3形態為多條藻絲組裝成緊密的繩索結構，這種超強繩索結構在功能上使藍藻能夠在泥沙及侵蝕的不穩定環境中成為生態穩定的開拓者，在傳統分類學上又是幾個屬定義的基礎特性，特別是微鞘藻屬(Microcoleus)和水鞘藻屬(Hydrocoleum)[28]。YJ-2與BI樹中聚在同一分支的細鞘絲藻(Leptolyngbya)比對結果存在4%的堿基差異，而與藻株Haloleptolyngbyasp. PMC895.15相似度高達100%且無堿基差異，但是YJ-2與三者的遺傳距離都較遠，而YJ-2形態觀察并無外鞘，可能為偽魚腥藻科細鞘絲藻屬親緣關系較近的一新物種。Patzelt D. J.[27]在對沙漠土壤藍藻多樣性的研究中可以看出細鞘絲藻屬(Leptolyngbya)呈現多樣性，在偽魚腥藻科多個分支中都有出現，還有部分以外類群出現，因此對于細鞘絲藻屬還需進行深入的分類研究。本研究觀察發現，在這7株結皮藻中，有一半的藻體外部形態特征具有鞘或者膠囊。這些鞘或者膠囊是微藻以不同形式排出的EPS[29]，能參與沙粒的黏附，促進生物結皮形成。