茶菊品種‘14-C-1’的CmF3H基因及啟動子克隆與表達分析

曹世哲，羅 昌，陳東亮，劉 華，程 曦，黃叢林*

(1 北京農學院 園林學院，北京 102206；2 北京市農林科學院 北京農業生物技術研究中心，北京 100097；3 北京市功能花卉工程技術研究中心，北京 100097)

菊花(ChrysanthemummorifoliumRamat)為菊科菊屬宿根草本花卉，不僅是重要的觀賞植物，而且是非常重要的食用、茶用和藥用植物。目前已有大量文獻報道了菊花中含有多種藥理和生物活性成分。其中，黃酮類化合物(flavonoids)是最重要的活性成分。黃酮類化合物別名類黃酮，是植物中一類對人類健康有重要價值的次生代謝產物，具有多種生物活性和藥用功效，如抗炎、抗氧化、抗癌、降血壓、降血糖、保護神經和調節機體免疫力等[1]。此外，黃酮類化合物還在植物自身生理生化過程中發揮重要作用，如對植物的生長發育起到控制調節作用，保護植物組織免受紫外線傷害、花的著色和種間相互作用的信號傳導，還能抵抗外界非生物脅迫以及昆蟲侵襲等[2-3]。目前已知的黃酮類化合物超過1萬種[4]，根據其基本分子結構的雜氧環和構象的不同，一般可劃分為黃烷酮(falvanone)、黃酮(flavones)、異黃酮(isoflavones)、黃酮醇(flavonols)、黃烷醇(flavanols)和花色素(anthoyanidins)六大類[5]。黃酮類化合物是由一系列酶催化而合成的2-苯基色原酮衍生物。

黃烷酮3-羥化酶(Flavanone 3-hydroxylase，F3H)屬于2-O-酮戊二酸和鐵離子依賴的雙加氧酶超家族(2-ODD)，是黃酮類化合物合成途徑分支點的一個核心酶，可將黃烷酮類底物還原為二氫黃酮醇類化合物，而二氫黃酮醇類化合物是合成黃酮醇和無色花色素類物質的前體物質[6-7]，從而F3H可間接調控黃酮醇、黃烷醇和花青素等黃酮類物質的合成，最終影響植物中黃酮類物質含量和植物花色[8]。第一次關于F3H活性的研究是在紫羅蘭(Matthiolaincana)中報道的，但因為酶活性低、不穩定，從紫羅蘭中純化該酶并沒有成功。F3H的第一次成功純化及鑒定是Britsch等[9]在矮牽牛(Petuniahybrida)的紅花突變體中進行的。

F3H基因最早由Martin等[10]從金魚草(AntirrhinummajusL)中分離得到，此后，研究人員陸續從銀杏(Ginkgobiloba)、玉米(Zeamays)、茶樹(Camelliasinensis)等植物中克隆并鑒定了F3H基因。目前關于F3H基因的深入研究，大部分集中在其色素生物合成功能方面。F3H基因在花青素合成過程中發揮著重要作用，Wisman等[11]在擬南芥中阻斷F3H基因的表達，導致擬南芥植株體內黃酮及花色素等含量變低；Jiang等[12]利用RNA干擾技術使草莓(Fragaria×ananassaDuch)中F3H基因沉默，液質聯用分析結果顯示草莓果實中花青素含量顯著降低。由此可見，F3H基因在植物花色素等黃酮類化合物合成途徑中具有重要作用。目前，關于茶用菊花中F3H基因及其啟動子序列的信息較少。

本試驗以作者團隊自育的茶菊(Chrysanthemummorifolium)品種‘14-C-1’為試驗材料，克隆并分析了CmF3H基團及其啟動子序列，利用熒光定量PCR分析了CmF3H基因在‘14-C-1’不同組織部位的表達水平，以期為深入研究CmF3H基因功能，提高茶菊黃酮類化合物含量，改良茶菊品質提供一定分子基礎。

1 材料和方法

1.1 材 料

本試驗所用材料為北京農業生物技術研究中心自育的茶菊(Chrysanthemummorifolium)品種‘14-C-1’，種植于25 ℃的玻璃溫室中。

1.2 方 法

1.2.1CmF3H基因的克隆取茶菊‘14-C-1’頂端葉片2～3片，利用RNA提取試劑盒(MiniBEST Plant RNA Extraction Kit, TaKaRa公司)，提取總RNA，再用PrimeScriptTMⅡ 1stStrand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa公司)將所提取RNA反轉錄為cDNA并檢測其濃度。根據F3H的保守序列，在轉錄組數據庫中通過Blast比對得到CmF3H基因相關的序列信息。利用Primer 6.0軟件設計特異引物CmF3H-F/R (表1)，進行PCR 擴增，反應程序為94 ℃變性 10 s，55 ℃ 退火15 s；72 ℃ 延伸1 min；32個循環。瓊脂糖凝膠電泳，切取特異片段，回收純化目的片段后連接到pGEM-T Easy載體上，轉化、測序，獲得CmF3H的ORF全長序列。

1.2.2CmF3H基因生物信息學和系統發育分析利用NCBI Conserve Domain Database分析CmF3H蛋白的保守結構域，利用ExPaSy(https://web.expasy.org/protparam/)在線預測CmF3H蛋白的分子量、等電點、不穩定系數、脂肪指數及疏水性等理化性質；下載其他物種F3H基因編碼氨基酸序列，利用DNAMAN軟件進行多重序列比對；運用MEGA7.0構建系統發育樹。

1.2.3CmF3H基因啟動子的克隆和元件功能分析取茶菊‘14-C-1’葉片，采用CTAB方法提取DNA，采用染色體步移試劑盒(Genome Walking Kit，TaKaRa公司)克隆CmF3H啟動子，根據CmF3H序列設計特異引物，SP1、SP2和SP3(表1)，三輪PCR模板依次為菊花基因組DNA、第一輪PCR產物和第二輪PCR產物，反應體系：10×PCR 緩沖液2.5 μL；Mg2+1.5 μL；dNTP(2.5mmol/L) 4.0 μL；AP(50 μmol/L) 1.0 μL；SP(10 μmol/L) 1.0 μL；DNA 1.0 μL；LA Taq 0.25 μL；ddH2O補充到25 μL，反應程序見試劑盒說明書。瓊脂糖凝膠電泳，切取特異片段，回收純化片段。將片段連接到pGEM-T Easy載體中，轉化、測序。采用數據庫(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)分析預測順式作用元件[13]。

表1 引物序列

1.2.4CmF3H基因在‘14-C-1’不同組織部位中的表達分析利用RNA提取試劑盒(MiniBEST Plant RNA Extraction Kit，TaKaRa公司)提取茶菊‘14-C-1’不同組織部位根、莖、葉、花蕾、舌狀花和筒狀花的RNA，消除基因組DNA，用反轉錄試劑盒(PrimeScript RT reagent Kit，TaKaRa公司)將所提取RNA反轉錄為cDNA并檢測其濃度。利用Primer 6.0軟件設計CmF3H特異性引物，qCmF3H-F/R，以UBIQUITIN基因為內參[14](表1)，參照實時熒光定量PCR試劑盒(SYBR Premix Ex Taq TM，TaKaRa公司)說明書進行操作，反應體系：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus，2×) 10 μL；cDNA 1.0 μL；qCmF3H-F 1.0 μL；qCmF3H-R 1.0 μL；ddH2O補充到20 μL，反應程序：95 ℃ 預變性30 s，95 ℃ 變性3 s，60 ℃ 復性30 s，40個循環，擴增儀器為Applied Biosystems StepOnePlusTMReal-Time PCR儀，設置3個生物學重復，采用2-ΔΔCT法計算相對表達量[15]。

1.2.5 數據分析試驗數據用SPSS 17.0軟件進行統計分析，并進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 菊花CmF3H基因的克隆及其結構域分析

以‘14-C-1’cDNA為模板，克隆得到約1 200 bp條帶(圖1)。測序結果表明CmF3H基因全長1 284 bp，開放閱讀框1 095 bp，編碼364個氨基酸。Blast蛋白序列比對發現，‘14-C-1’CmF3H與菊花栽培種‘SU07’的氨基酸序列相似性最高，為99.16%。

M. DL2000；1. CmF3H圖1 茶菊‘14-C-1’CmF3H基因克隆電泳檢測Fig.1 Analysis of CmF3H gene from Chrysanthemum morifolium ‘14-C-1’

紅色方框表示2-O-酮戊二酸和Fe(Ⅱ)依賴性雙加氧酶結構域；‘14-C-1’CmF3H. 茶菊‘14-C-1’；‘SU07’CmF3H. 菊花‘SU07’；RrF3H. 玫瑰；CsF3H. 茶樹；MaF3H. 桑樹；GhF3H. 棉花；PnF3H. 三七；CaF3H. 喜樹；VcF3H. 藍莓；CtF3H. 紅花；CcF3H. 矢車菊；DpF3H. 大麗花圖2 ‘14-C-1’CmF3H與其他物種同源蛋白F3H氨基酸序列比對Red frame. Functional region of 2-oxoglutarate (2OG) and Fe (Ⅱ) -dependent oxygenase；‘14-C-1’ CmF3H. Chrysanthemum morifolium ‘14-C-1’; ‘SU07’ CmF3H. Chrysanthemum morifolium ‘SU07’; RrF3H. Rosa rugosa; CsF3H. Camellia sinensis; MaF3H. Morus alba; GhF3H. Gossypium hirsutum; PnF3H. Panax notoginseng; CaF3H. Camptotheca acuminata; VcF3H. Vaccinium corymbosum; CtF3H. Carthamus tinctorius; CcF3H. Centaurea cyanus; DpF3H. Dahlia pinnataFig.2 Alignment of amino-acid sequences between ‘14-C-1’ CmF3H and F3H homologues from other species

與玫瑰、茶樹、桑樹、棉花、三七、喜樹、藍莓、紅花和大麗花等物種的F3H氨基酸序列相似性分別為81.88%、81.19%、79.46%、79.76%、83.39%、80.24%、83.75%、80.90%和82.97%。氨基酸序列多重比對(圖2)發現，CmF3H蛋白序列含有2-O-酮戊二酸和Fe2+-依賴的雙加氧酶家族的保守結構域(從第200個氨基酸到第300個氨基酸)，推斷它在菊花黃酮類化合物合成過程中發揮著與其他物種F3H蛋白相同或相似的功能。

2.2 CmF3H基因生物信息學和系統發育分析

蛋白序列結構分析表明，CmF3H分子量為41.19 kD，等電點為5.57，不穩定系數為39.51，平均親水性為-0.465，脂肪指數為83.02，表明該蛋白為穩定、疏水性蛋白。用亞細胞定位預測與分析網站對CmF3H進行定位預測，結果顯示，細胞質60.9%，細胞核26.1%，線粒體4.3%，液泡4.3%，分泌系統的小泡4.3%。由此得出，CmF3H主要定位在細胞質內。

圖3 茶菊‘14-C-1’與其他物種F3H的進化樹分析Fig.3 F3H phylogenetic tree analysis of C. morifolium ‘14-C-1’ and other species

M.DL2000；1、3、5、7. 二輪PCR產物，引物分別為AP1+SP2、AP2+SP2、AP3+SP2和AP4+SP2；2、4、6、8. 三輪PCR產物，引物分別為AP1+SP3、AP2+SP3、AP3+SP3和AP4+SP3圖4 茶菊‘14-C-1’CmF3H基因啟動子克隆電泳檢測M. DL2000; 1, 3, 5, 7. The second round of PCR products, primer is AP1+SP2, AP2+SP2, AP3+SP2 and AP4+SP2; 2, 4, 6, 8. The third round of PCR products, primer is AP1+SP3, AP2+SP3, AP3+SP3 and AP4+SP3Fig.4 Analysis of CmF3H gene promotor from C. morifolium ‘14-C-1’

系統進化樹分析(圖3)表明，茶菊‘14-C-1’與菊花栽培種‘SU07’親緣關系最近。其次為菊科植物大麗花、矢車菊，與玫瑰、三七、茶樹等親緣關系較遠。

2.3 CmF3H基因啟動子序列的克隆與分析

克隆獲得‘14-C-1’CmF3HORF上游長1 217 bp(圖4)。啟動子序列分析(表2)顯示CmF3H基因啟動子除包含真核生物核心啟動子元件TATA-box、AT～TATA-box和CAAT-box外，還含有MYB識別位點MYBCORE、MYBCOREATCYCB1和MYB2CONSENSUSAT，以及調控功能元件：光響應元件BOX4和IBOXCORE、光響應與組織特異性表達元件G-box和GATA-box、ABA響應元件MYB1AT、干旱和ABA響應元件MYC、熱誘導元件CCAAT-box、種子發育調控元件ACGTC-box等，這些元件表明該啟動子很可能受光、ABA、干旱等外界環境因素的調控。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)圖5 茶菊‘14-C-1’不同組織部位CmF3H基因相對表達量Different normal letters indicate significant difference at 0.05 level (P<0.05)Fig.5 Relative expression of CmF3H gene among different tissues of C. morifolium ‘14-C-1’

2.4 CmF3H基因在‘14-C-1’不同組織部位中的相對表達量

熒光定量PCR分析結果(圖5)顯示，CmF3H在‘14-C-1’筒狀花中表達量最高，其次為莖、花蕾、葉、舌狀花，在根中的表達量最低。其中筒狀花的表達量與根、莖、葉等組織部位的表達量均存在顯著性差異。

3 討 論

目前，人們對植物中次生代謝產物的研究主要集中在黃酮類化合物、萜類化合物和生物堿等物質。其中黃酮類化合物是多種藥用植物有效成分之一。黃酮類化合物合成途徑的關鍵酶為F3H[16]。通過開展F3H基因及其啟動子的克隆與功能分析，為提高植物中黃酮類化合物的含量提供理論支持，有助于藥食兩用植物的品質改良。

本試驗從茶菊品種‘14-C-1’中克隆得到黃酮類化合物合成相關基因CmF3H。氨基酸序列分析表明，CmF3H編碼氨基酸與其他物種F3H編碼氨基酸序列有較高相似性，且具有2-O-酮戊二酸和Fe2+-依賴的雙加氧酶家族的保守結構域，屬于2-酮戊二酸依賴雙加氧酶蛋白家族。系統進化分析顯示，CmF3H蛋白序列與菊科植物如‘SU07’、大麗花、矢車菊、紅花等聚為一類，說明F3H基因序列在菊科中的保守性相對較高，在基因進化方面不屬于活躍類型，在基因表達的過程中，一般不會出現個別堿基的缺失或突變，從而保證在植物黃酮類化合物合成過程中正常表達發揮作用。單拷貝基因能被更好的調節控制，F3H基因在大多數植物中以單拷貝形式存在，如玉米、矮牽牛、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、山葡萄(Vitisamurensis)等，但也存在多拷貝形式，如葡萄(Vitisvinifera)中有2個拷貝[17-18]，紫蘇(Perillafrutescens)中有2～3個拷貝[19]，小麥(Triticumaestivum)中存在4個拷貝[20]。

表2 茶菊‘14-C-1’CmF3H基因啟動子元件分析

研究表明，F3H基因在植物不同組織和不同發育時期的表達量不同。Kumar等[21]對余甘子(Phyllanthusemblica)中F3H基因在不同組織部位及不同時期的表達進行分析，發現PeF3H基因在花朵中的表達量較葉片和果實高，在果實成熟的過程中該基因表達量逐漸升高。毛玉珊[22]對檸條(Caraganakorshinskii)F3H基因組織特異性進行分析，發現CkF3H基因在檸條根、莖、葉中均有不同量的表達。本試驗通過qRT-PCR對茶菊‘14-C-1’不同組織部位CmF3H基因相對表達量表明，CmF3H基因在根、莖、葉、花蕾、舌狀花和筒狀花中均有不同量的表達，表明該基因在茶菊‘14-C-1’中存在組織特異性；在筒狀花中表達量最高，且顯著高于其他組織部位的表達量，推測筒狀花中所積累的黃酮類化合物如花色素類、黃酮醇類、黃烷醇類等物質高于其他組織部位，為以后茶用菊花育種和品質改良提供參考。

F3H基因功能的研究表明，F3H基因的表達受UV-B、鹽、干旱、光照等多種因素的調控，在模式植物煙草中過表達F3H基因可提高轉基因植株中黃酮類化合物的含量及其抗逆能力。Liu等[23]研究發現在UV-B輻射和干旱脅迫下，沙漠植物紅砂(Reaumuriasoongorica)RsF3H酶活性增加，黃酮類化合物合成途徑中產物積累，qRT-PCR分析表明，RsF3H基因的表達迅速增加；Mahaja等[24]研究發現鹽脅迫下茶和轉基因煙草(Nicotianatabacum)中F3H基因的表達量及酶活性都顯著上升，黃烷-3-醇含量增加，對鹽脅迫的耐受性明顯增強；Song等[25]克隆枸杞(Lyciumchinense)的F3H基因并在煙草中過表達，試驗結果表明，轉基因煙草植株黃烷-3-醇的含量升高，抗氧化能力增強，對干旱脅迫的抵抗力增強。此外，F3H基因還能夠在植物受到生物脅迫時發揮作用，Gutiérrez-Albanchez等[26]用芽孢桿菌QV15誘導黑莓(Rubuscv. Loch Ness)，試驗結果表明RuF3H基因可改善植物在受到生物脅迫的適應性，提高果實品質。

不同的環境因素影響植物的生長發育，植物可以通過啟動子中的順式元件與轉錄因子相互協調，對脅迫產生應答。本研究中，CmF3H基因啟動子序列存在多個與光照、溫度、UV-B、ABA等相關的元件，以及MYB識別位點等。MYB轉錄因子普遍存在于植物中，廣泛參與植物的生長發育和代謝調控，在非生物脅迫(如干旱、低溫、高鹽以及紫外輻射等)條件下，該轉錄因子的表達會發生特異性變化，增強植物適應復雜多變環境的能力。有研究表明MYB識別位點MYBCORE能調控牽?；ɑò晟媳砥S酮類化合物的生物合成[27]。茶菊品種‘14-C-1’CmF3H基因是否能夠響應不同脅迫及ABA處理，進而影響黃酮類化合物成分的合成，還需進一步研究。

本試驗成功從茶菊‘14-C-1’中克隆了CmF3H基因及其啟動子，在后續的研究中將通過構建過表達載體進行轉基因試驗，并分析轉基因植株中黃酮類化合物成分和含量，探究CmF3H的生物學功能。為后續茶菊分子育種提供有效基因元件，為獲得高含量黃酮的茶菊品種奠定堅實的基礎。