紫花含笑花被呈色過程中色素含量與超微結構的變化特征

余秋岫，金曉玲，羅 峰，劉彩賢*

(1 中南林業科技大學 風景園林學院，長沙 410004；2 廣州市綠化公司，廣州 510000)

花色創新是花卉育種的重要內容，研究色彩形成的原因對于新型觀花品種的選育具有重要意義[1]?；ㄉ菑碗s的表型性狀，花瓣色素種類及其含量是影響月季[2]、部分忍冬屬[1]植物呈色的主要原因。除受色素類型與比例影響外，還有細胞液pH值、光照、溫度等多種因素的影響[3-4]，其中花瓣表皮細胞形態是影響花色變化的重要因素之一[5]。Zhang等[6]提出錐形細胞將光線聚焦到內部花色素上，從而增強花瓣顏色的強度[7]；不同花色菊花徒手切片結果表明，圓錐形上表皮細胞結構入射光進入細胞比例比扁平形增加[8]。另外，對萬壽菊舌狀花超微結構觀察發現，葉綠體向有色體的結構轉變可導致花色呈橘黃色變化[9]。

紫花含笑 (Micheliacrassipes) 是木蘭科 (Magnoliaceae) 含笑屬 (Michelia) 常綠小喬木或灌木，花色紫紅，是含笑屬中為數不多紫色系植物，近年來常用作雜交親本進行木蘭科植物花色改良[10-11]。目前，對紫花含笑的研究主要集中在孢粉學[12]、生物學特性[13]、雜交新品種選育[11,14]、無性繁殖方式[15-16]以及花葉提取物開發[17]等方面，據觀察其花被在蕾期完成由綠轉紫的著色過程，現蕾時為綠色而在花蕾期花冠呈紫色，但紫花含笑花被顏色形成的機理尚不明確，花被的形態結構及其對呈色影響也無報道。本研究采用光鏡和電鏡方法觀察比較不同顏色花被顯微及超微結構，結合花色表型分析花被呈色過程中花色素和細胞結構差異，為探討紫花含笑的花色呈色機制提供依據，也為木蘭科植物花色育種及功能利用提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料采自湖南省林業廳木蘭科資源圃的健康紫花含笑植株。根據花期發育過程中花被顏色的變化進程，分為綠被期和紫被期2個階段。分別取綠色和紫色花被片作為石蠟切片、掃描電鏡、透射電鏡及色素含量分析試驗材料(圖1)。取樣時去除花被基部與頂部位置，取花被2/3的部分。

1.2 觀測指標及方法

1.2.1 花色表型測定參照張楊青慧等[3]的方法，用CM-700d型號色差儀(Konica minolta，Japan)對紫花含笑花被上表皮進行測量，獲得花色明度(L*值)、色相a*和b*值，彩度C*值和色相角度h根據公式計算[18]，5次生物學重復。其中，C*=(a*2+b*2)1/2,h=arctan(b*/a*)

1.2.2 花被色素含量類黃酮含量分析采用Flavonoid Kit比色試劑盒法(南京建成生物工程研究所)；花青素含量提取采用1%鹽酸溶液水解法[19]；葉綠素及類胡蘿卜素含量測定參照于娜[20]乙醇浸提法。所有指標含量測定均設3次生物學重復，每個生物學重復均設3次技術重復。

1.2.3 花被表皮色素分布觀察參照程怡等[21]方法，尖頭鑷子撕下花被2/3處上表皮，于EVOS XL Core細胞成像系統40倍鏡下拍照觀察。

1.2.4 花被石蠟切片樣品制備及觀測以綠色和紫色花被為試材，取花被2/3處置于FAA固定液中，采用常規石蠟切片法制片[9,22]觀測。利用數字切片掃描系統Motic VM1(廈門麥克奧迪實業集團有限公司)觀察、拍照，用Digimizer 4.5.1軟件測定花被表皮形態，包括上表皮長度、寬度及其長寬比。

1.2.5 花被掃描電鏡樣品制備及觀測參照肖文芳[5]的方法。從紫花含笑植株上采集新鮮花朵，用蒸餾水漂洗干凈；截取大小為5 mm×5 mm樣品，置于戊二醛固定液中；用磷酸緩沖液對樣品進行沖洗，共3次，每次10 min；用30%～100%乙醇梯度脫水處理；用醋酸異戊酯替換掉細胞中的乙醇，2次，每次15 min；使用真空冷卻干燥器進行干燥處理； 樣品粘附在鋁制托盤，用離子濺射鍍膜儀(IB-5 型)在樣品表面鍍1層金屬膜；使用JSM-6390 LV 掃描電鏡(Hitachi，Japan)對樣品進行觀察及拍照記錄。

圖1 紫花含笑花被變色前后上表面Fig.1 The upper surface of different color perianths in Michelia crassipes

1.2.6 花被透射電鏡樣品制備及觀測取花被2/3部分，剪成小細條，迅速放入2%戊二醛固定液中，抽真空防止材料上浮，4 ℃保存；4 ℃，1%四氧化鋨(OsO4)固定3 h；30%～100%乙醇梯度脫水處理；環氧樹脂812包埋劑包埋樣品；超薄切片機切片，分別置于乙酸雙氧鈾[UO2(CH3COO)2·2H2O]、檸檬酸鉛(C6H5O7Pb)中染色；于透射電鏡下觀察(H-7650，Hitachi，Japan)。

1.3 數據統計與分析

采用Origin 2017繪制圖表和SPSS 2.0軟件對試驗數據進行統計以及逐步回歸分析，指標的相關性采用Pearson相關系數評價。

2 結果與分析

2.1 紫花含笑花色變化過程中花被表型參數和色素含量變化特征及其相關性

2.1.1 花色表型參數如圖2，A所示，不同顏色花被L*、a*、b*差異明顯。其中，隨著花被顏色由綠轉紫，其明度L*值大幅降低；色相a*值上升表示由綠到紅的變化，花被顏色向紅色相偏移，色相b*值大幅降低說明顏色由黃轉藍的變化趨勢；彩度C*值大幅降低，色相角h則上升。

2.1.2 色素含量圖2，B顯示，在紫花含笑花被呈色過程中，花被類黃酮、花青素和類胡蘿卜素含量呈現上升趨勢，葉綠素則呈下降趨勢。其中，在花色由綠轉紫變化過程中，花被類黃酮含量上升了1.2倍，花青素含量上升了3.25倍，類胡蘿卜素含量上升了11.3倍，而葉綠素含量下降了1.05倍；但與其他色素含量相比，花被類胡蘿卜素總含量上升幅度最大，含量卻最低。同時，比較紫花含笑花被呈色變化過程中花青素與其他各色素含量比值，發現花被花青素/類黃酮略微有所增大，花被花青素/葉綠素明顯增大，增加了7.69倍，而花被花青素/類胡蘿卜素卻顯著降低了65.48%；但就比值大小而言，不同顏色花被均以花青素/類胡蘿卜素最大，花青素/葉綠素次之，花青素/類黃酮最小(圖2，C)。

2.1.3 花色表型與色素含量的關系從簡單相關分析結果(表1)可知，花被片明度L*值與a*值呈極顯著負相關，同時與花青素、類黃酮、類胡蘿卜素及花青素/類黃酮、花青素/葉綠素的比值也呈負相關，而與b*值、葉綠素含量及花青素/類胡蘿卜素呈正相關；a*值與b*值、葉綠素含量及花青素/類胡蘿卜素呈負相關，與花青素、類黃酮和類胡蘿卜素含量及花青素/類黃酮、花青素/葉綠素呈正相關；b*值與葉綠素含量和花青素/類胡蘿卜素呈正相關，與花青素、類黃酮、類胡蘿卜素含量、花青素/類黃酮和花青素/葉綠素呈負相關。可見，在紫花含笑花被花色由綠轉紫的過程中，花被表面明度L*降低，花色紫紅變化程度主要與花青素、類黃酮、類胡蘿卜素等色素含量以及花青素/類黃酮、花青素/葉綠素呈顯著正相關，而與葉綠素含量和花青素/類胡蘿卜素呈顯著負相關；各色素間相互影響，相互制約，共同影響花被呈色。

圖2 紫花含笑不同顏色時期花被表型參數和色素含量、比值比較Fig.2 Comparison of phenotypic parameters, pigment content and ratio of perianth in different color periods of Michelia crassipes

表1 各指標間簡單相關性分析

同時，簡單相關分析中與花被呈色表現出極顯著相關因素較多，進一步對各色素含量變化進行逐步回歸分析，擬從不同花色素中找到花色(a*、b*)影響最顯著的因子。在5%的顯著水平下，逐個淘汰不顯著自變量，選出偏回歸系數達到顯著或極顯著水平的因子，進入花色的回歸方程(表2)。如表2所示，花被色度a*值的逐步回歸方程中，僅保留了花青素1個因子，且二者呈現正相關關系，其余因子全部被剔除；花被色度b*值的逐步回歸方程中，也只保留了花青素1個因子，但二者呈負相關關系。這一結果表明，花青素對紫花含笑花冠呈紫色有顯著作用。

綜合以上分析，花被中各色素組分的相對含量變化共同影響紫花含笑呈色，其中花青素含量上升以及類胡蘿卜素、類黃酮等含量增加輔助增色可能是紫花含笑花被顯紫色的主要原因，同時還伴隨著葉綠素的降解。

2.2 紫花含笑花被上表皮色素分布特征

通過40倍光鏡觀察紫花含笑花被上表皮徒手切片(圖3)發現，綠色花被中主要是葉綠素分布，未觀察到花青素的存在(圖3，A)；而紫色花被中，花青素出現，并大面積分布于上表皮中，葉綠素含量降低(圖3，B)。因此，花青素的出現可能是紫花含笑花冠著紫色的主要原因。

2.3 紫花含笑花被表皮細胞形態特點

2.3.1 基本形態特點對不同顏色花被的上表皮細胞長度、寬度及長寬比進行統計分析，發現不同花色花被的細胞形態存在差異。其中，綠色花被上表皮細胞近似為正方形，細胞排列緊密、間隙小，表面平整(圖3，C)，細胞面積較小，長寬比為1.497(表3)；紫色花被上表皮多為橢圓形，單個細胞的裸露面大于細胞間接觸面，表面呈弧形，細胞面積較大，長寬比為1.855(圖3，D；表3)。

表3 紫花含笑不同顏色花被上表皮細胞解剖形態比較

2.3.2 不同顏色花被片上表皮細胞形態比較肖文芳等[5]將蝴蝶蘭花瓣表皮細胞形態分為扁平型、穹頂型、長穹頂型和乳突型。本試驗掃描電鏡觀察發現，紫花含笑綠色花被上表皮細胞形態完整，均為扁平型(圖4，A)，細胞基本飽滿，細胞間隙處有輕微皺縮；細胞排列緊密，基本處于同一個平面，無空隙，具氣孔器(圖4，B)。紫花含笑紫色花被除氣孔器外(圖4，C)，上表皮細胞垂周壁上覆蓋不規則的褶皺條紋，條紋間有空隙；細胞凸起為穹頂型，細胞排列緊湊但不處于同一個平面，單個細胞呈弧形凸起(圖4，D)?；ū簧媳砥そY構觀察結果表明，花被呈紫色過程中，表皮細胞由扁平型向圓錐凸起變化，單個細胞長寬比增大，細胞垂周壁出現褶皺，表皮結構形態上向增加光照吸收面積變化。

A、C.綠色花被；B,D.紫色花被;ue.上表皮; le.下表皮圖3 紫花含笑不同顏色花被上表皮色素分布及細胞形態變化A,C. Green tepal; B,D. Purple tepal; ue. Upper epidermis; le. Lower epidermisFig.3 The pigment distribution and transverse sections of upper epidermal cells in different color perianth of Michelia crassipes

A.綠色花被上表皮；B.綠色花被表皮細節圖；C.紫色花被上表皮；D.紫色花被表皮細節圖圖4 紫花含笑變色前后花被表皮結構變化A. The upper surface of green tepal; B. The details of upper surface of green tepal; C. The upper surface of purple tepal; D. The details of upper surface of purple tepalFig.4 Electron microscopic images of the upper surface of different color perianth in Michelia crassipes

A～C. 綠色花被:A. 花被超顯微結構;B. 細胞結構;C.葉綠體結構細節圖;D～F. 紫色花被:D. 花被超顯微結構;E. 細胞結構圖;F.有色體結構細節圖;Chl.葉綠體;g.基粒;O.黑色嗜鋨滴;V.液泡;M.線粒體;N.細胞核;IS.細胞間隙;P.質體;S.淀粉粒圖5 紫花含笑兩種顏色花被超顯微結構比較A-C. Green tepal: A. Ultrastructure of petals of green tepal; B. Cellular structure diagram; C. The details of chloroplasts; D-F. Purple tepal: D. Ultrastructure of petals of purple tepal; E. Cellular structure diagram; F. The details of chromoplasts; Chl. Chloroplast; G. Granum; O. Osmiophilic droplet; V. Vacuole; M. Mitochondrion; N. Nucleus; IS. Intercellular space; P. Plasmid; S. Starch grainsFig.5 Ultrastructure of perianth with different colors in Michelia crassipes

2.3.3 不同顏色花被細胞超微結構差異從兩種顏色花被表皮結構觀察可知，不同顏色花被表皮結構有所差異，現進一步對花被細胞進行超顯微觀察。結果顯示：紫花含笑綠色花被細胞有豐富的細胞器，尤以葉綠體和線粒體居多，細胞核結構清晰，細胞質充盈，細胞間隙較寬；液泡體積小而分散，在細胞中與其他細胞器體積約各占1/3～1/2(圖5，A、B)；葉綠體體積較大，呈長橢圓形，內部基粒片層結構清晰(圖5，C)；花被細胞中存在大量黑色嗜鋨滴，多為圓形且體積較大(圖5，A～C)。

紫花含笑紫色花被細胞間隙相比綠色花被窄，細胞間結構相對飽滿；出現葉綠體轉化為有色體的超顯微結構，但有色體結構細胞器數量不多，中央大液泡占據花被細胞體積最大(圖5，D)，多數細胞中央大液泡體積幾乎占據整個細胞，將細胞器擠壓向細胞邊緣凝聚；偶有細胞淀粉粒及質體球占據細胞中央(圖5，E)；存在巨大的淀粉粒現象，淀粉粒近似為圓形或多邊形，質體球體積較大(圖5，F)。該結果表明，隨著花被顯紫色，液泡體積增大與葉綠體向有色體轉化是主要的細胞器變化。

3 討 論

色素組成及其含量的時空組合是決定花色形成的重要因素[1,4,18]，本研究中通過相關分析以及逐步回歸方程發現，紫花含笑花被顯紫色可能是花青素含量顯著上升，伴隨著葉綠素的降解，以及類黃酮和類胡蘿卜素含量增加起輔助增色作用所致，結果與Liu[23]研究一致?；ㄇ嗨睾孔兓彩怯绊懨赊r紅豆草[24]、麗格海棠[25]等植物花瓣呈色的主要色素。黃酮或黃酮醇等類黃酮物質本無色，有顯著的輔助色素效應，即與花青苷結合呈現增色效應及紅移[1,26-27]，類胡蘿卜素與花青素復合也產生不同色調的紅色[8]。本研究中紫花含笑花青素、類黃酮和類胡蘿卜素含量變化及花青素/葉綠素與紅度a*值呈顯著正相關，與明度L*值、b*值顯著負相關，這與王藝光等[28]發現類胡蘿卜素的積累改變桂花花瓣的紅度a*值結果一致，也與花青素含量積累降低花瓣明度和黃色程度，有利于睡蓮花色紅色化原因相似[29]。

花瓣錐形表皮細胞形態能夠影響其光捕獲能力和光的反射比[30]。菊花[8]和萬壽菊[9]細胞表型對花色變化的影響研究表明，圓錐形結構相比扁平狀結構入射光進入花瓣表皮細胞的比例增加而花色加深。本研究中，紫花含笑花被呈色前后上表皮細胞結構差異性變化與前人結果一致，即綠色花被表皮細胞扁平規整，而紫色花被上表皮細胞呈橢圓形凸起，表皮細胞長寬比變化與色素含量均呈顯著相關；而且細胞垂周壁覆蓋褶皺條紋，說明花瓣表皮細胞表面積增大，可能有利于入射光的吸收。

植物花色與花瓣細胞中質體的結構具有密切關系，煙草花蜜腺綠色轉橙過程中出現葉綠體向有色體轉化，并伴隨著一定程度的液泡增大[31]；矢車菊盛花期花瓣液泡明顯增大并且存在有色質體[32]，葉綠體、淀粉體轉化為積累類胡蘿卜素的有色體細胞器結構，是花、果實顏色黃轉橙的主要原因之一[9,33-34]。本研究中，紫花含笑花被超微結構觀察發現，細胞液泡體積增大及有色質體的轉化是其花被呈紫色的主要細胞結構變化。紫花含笑花冠轉紫色過程中液泡體積占比從1/3直達2/3以上，更甚者幾乎占據整個細胞，出現了葉綠體結構向淀粉粒以及有色體轉化，但數量不多，與紫被期葉綠素降解、類胡蘿卜素含量有明顯增加但含量較少結果一致?？紤]到花青素苷在細胞質中合成，在液泡中積累[26]，因此推測紫花含笑由綠轉紫過程中，隨著花青素的合成和轉運，最終積累在液泡中從而導致液泡體積的增大。另外，在綠色花被細胞內存在大量黑色嗜鋨滴，即油細胞等脂類物質被鋨酸固定為嗜鋨滴，許多含鋨酸物質的質體是精油的合成場所[35-36]，因此推測綠被期是花香物質合成的重要時期。

綜上所述，紫花含笑花被呈色過程中，花青素的積累伴隨著類胡蘿卜素及類黃酮等色素含量增加輔助增色可能是其花被呈紫色的主要原因，細胞結構上表現為液泡體積增大，葉綠體向有色體轉化。花被呈色是多因素作用的結果，為更好地詮釋其花被呈色的成因，尚需從植物體內色素代謝調控及其轉錄調控開展深入研究，此結果為今后木蘭科花色呈色機制研究提供細胞學依據。