植物小分子肽的研究進展

藺 歡，王俊娟,2，孫振婷,2，朱偉東，葉武威，2，陰祖軍，2*

(1 中國農業科學院 棉花研究所/棉花生物學國家重點實驗室，河南安陽 455000； 2 鄭州大學 農學院，鄭州 450000；3 中國農業科學院 深圳農業基因組研究所，廣東深圳 518000)

植物細胞通過短距離和長距離的通訊進行細胞間的交流，從而調節生物過程來協調生長和發育。為了確保正確的信號交流模式和功能調控，通過植物激素、移動轉錄因子、非編碼RNA和多肽信號分子等幾種信號分子的胞間通訊模式來實現這種需求[1-2]。植物激素從一個細胞到另一個細胞進行定向轉運，具有特異性和方向性，這就為植物的胞間交流提供了一種特定的發育模式[3-5]。植物的胞間互作主要由激素類的親脂性小分子化合物完成，如生長素、細胞分裂素、赤霉素、脫落酸、茉莉酸、乙烯和油菜素內酯等, 這些激素存在于各個器官組織并參與植物的不同生長發育階段和復雜的脅迫應激等生命過程，它們作為信號分子在胞間通訊和交流過程中發揮著重要的作用[6-7]。再者，轉錄因子(transcription factors，TF)通過胞間連絲進行直接同向轉運信號，這種胞間信號傳導方式也得到了廣泛的研究。轉錄因子是編碼特定轉錄因子蛋白的基因家族類型，它們的靶基因形成一種調節因子，參與調控植物生長發育和非生物應激反應相關基因的抑制和激活，如研究較為成熟的NAC基因家族主要參與調控植物的抗旱、耐寒和耐鹽堿[8-10]，煙草(Nicotianatabacum)植物中bZIP(basic leucine zipper)家族成員中的EcbZIP17，可以提高轉基因植株的發芽率、生物量和存活率[11]。更有趣的是，microRNAs也被認為是胞間信號分子，研究證實miRNA165/166可以在莖頂端分生組織和根尖分生組織短距離移動，調控原生木質部細胞的生長發育過程[12-13]。作為胞間通訊的信號肽分子在動物體內已經被研究了很多年，然而在植物中，人們歷來對非肽類親脂性植物激素(如生長素)的高度關注，卻使信號肽的重要性顯得相形見絀。近年來，大量的生化和遺傳研究表明, 植物信號肽同樣也參與了植物的生長發育和應激反應過程, 包括細胞增殖、維管束形成、自交不親和的識別、分生組織的細胞平衡和組織脫落、防御反應等[5, 14-16]。此外，富亮氨酸重復受體樣激酶(LRR-RLKs)等一些受體的發現和鑒定，也進一步強調了信號肽在植物發育中的重要性[16-17]。

1 植物小分子肽的發現

胰島素是人類在動物體內發現的第一個小分子肽，在動物生理調節過程中發揮著重要的作用，隨后在此基礎上又發現了眾多的小分子肽，它們對動物生長發育和抵抗疾病方面都起著非常重要的作用[6]。而在植物體內小分子肽的研究還未超過30年，Pearce等于1991年在番茄(Solanumlycopersicum)中發現了植物中的第一個小分子肽——系統素。成熟的系統素包含18個氨基酸殘基，由一種叫做原系統素酶的200個氨基酸前體加工而成，主要參與調控番茄對病蟲害引起的傷害反應[18-19]。

小分子肽是重要的胞間信號感應分子，主要參與調節植物的生長發育過程和應答生物和非生物脅迫的應激反應。已有研究表明，肽信號在植物胞間通信過程中發揮了比預期更大的作用。一些信號肽在植物生長發育過程中起信號傳導作用，而另一些則參與防御反應或共生過程[20-21]。大多數的小分泌肽蛋白前體都含有前體結構域，需要經過加工處理過程才能獲得具有生物活性的成熟肽。迄今為止，大多數具有特征的植物肽作為小信號肽或抗菌肽來源于較大的非功能性前體蛋白，該前體蛋白無生物活性，因此由 N 端信號肽序列引導蛋白進入分泌途徑。這些新類型的信號肽進一步增加了植物小肽研究的復雜性，盡管它們的數量仍然有限，但是人們對其研究發現的翻譯證據和功能特征還具有爭議[22-23]。目前被普遍承認并可能起激素作用的植物小分子肽包括以下幾類：系統素(Hyp Sys)、CLAVATA3/胚胎周圍區域相關肽(CLE)、C端編碼肽(CEP)、植物磺化激動素(PSK)、S位點富含半胱氨酸蛋白(SCR)、早期結瘤蛋白(ENOD40)、一類參與花器官脫落的多肽(IDA)、快速堿化因子(RALF)、表皮模式因子1和2(EPF1、EPF2)、根生長因子(RGF)/GOLVEN(GLV)/CLEL肽、絨氈層決定因子(TPD1)、氣孔蛋白類肽9 (EPFL9)等[5-6, 23-24]。

2 植物小分子肽的結構特點與系統分類

成熟的肽段很小，通常由20個氨基酸殘基組成，極少數前體的全長會超過120個氨基酸殘基，并且在植物體內通常以很低的生理濃度存在，但是成熟肽段在同源基因之間具有極高的保守性，這對家族成員的挖掘提供了方便[20]。由于信號肽在生物體內的表達水平極低，因此對小肽的挖掘和研究進一步復雜化，這對研究者們將是一個非常大的挑戰[25]。

肽信號可分為分泌型多肽和非分泌型多肽。Matsubayashi等[26]將分泌型肽信號分為兩類:一類是通過復雜的翻譯后修飾，然后進行廣泛的蛋白水解過程而產生的，被稱為翻譯后修飾小肽；另一類以存在多個分子內二硫鍵為特征，并且此類信號肽中一些經歷蛋白水解過程，一些不經歷蛋白質水解過程，但都被統一定義為富含半胱氨酸多肽[5, 19]。華春等[27]在2015年又將所有植物的多肽信號根據是否分泌、是否存在N端信號、胞外還是胞內起作用分為四大類: 胞外起作用的翻譯后修飾分泌型小肽、胞外起作用的富含半胱氨酸分泌型多肽、胞外起作用的非分泌型多肽和胞內起作用的非分泌型多肽[5, 18, 28-29]，所包括的基因及其功能如表1所示。

在某些情況下，非分泌型多肽既可通過胞內信號轉導調控細胞功能，也可從受傷的細胞中釋放出來直接參與植物的防御反應等[27]。系統素屬于胞外起作用的非分泌型多肽，是一種從番茄葉片發現的長為18個氨基酸的肽，它主要在受傷部位釋放信號。這類肽能夠引起懸浮液培養細胞的堿化，誘導防御蛋白酶抑制劑蛋白的合成，并系統地發出信號，激活整個植物的防御基因[18-19]。早期結節蛋白因子ENOD40是胞內非分泌型多肽的代表之一，該基因的顯著特征是存在短的開放閱讀框ORF(少于100個氨基酸)，在多種豆科植物中都高度保守，主要是編碼的短肽發揮功能[30]。先前的研究發現，ENOD40基因的一些功能可能是由編碼的RNA結構決定，主要在根瘤器官的形成和生長中具有重要作用，并參與調控豆科植物與細菌或真菌的共生，在非共生植物發育過程中也普遍發揮作用[31-33]。最新的一項研究也支持了該結論，定位于核小體的RNA結合蛋白1 (RBP1)首次在蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)中被鑒定，作為一種長鏈非編碼RNA(lncRNA)，它可與早期結瘤基因ENOD40 (EARLYNODULIN40)相互作用，重新轉運至細胞質參與蒺藜苜蓿共生結瘤的形成[30]。擬南芥(Arabidopsisthaliana)中與RBP1進化關系最近的兩個同源物被稱為核小體RNA結合蛋白(nuclear speckle RNA-binding proteins, NSRs)，它們被鑒定為mRNA的特異可變剪接調節因子，并在體內識別其他長鏈非編碼RNA剪接競爭因子，從而調節側根的形成[34]。雖然ENOD40似乎具有多種功能，但其活性分子的調控路徑和表達機制尚不清楚。

分泌型多肽包括翻譯后修飾小肽和富含半胱氨酸多肽，主要通過自由擴散方式分泌到胞外空間，對相鄰細胞的命運起決定性作用[27]。一些翻譯后修飾小肽的特征是結構上存在由特定修飾酶介導的翻譯后修飾，如酪氨酸硫酸化(PSK、PSY和RGF)、脯氨酸羥基化(現發現的小肽中除了PSK沒有脯氨酸殘基,其他所有翻譯后修飾小肽都有羥脯氨酸殘基)和羥脯氨酸阿拉伯糖基化(PSY1、CLV3、CLE2、CLE9和CLE-RS2)以及連續的蛋白水解過程，這些修飾可能會在構象上改變肽的活性或非活性狀態。它們的成熟肽段很短，一般少于20個氨基酸，是蛋白質水解過程中的結果[27, 35]。這些多肽最初翻譯成具有N端分泌信號的約100個氨基酸殘基的前體多肽，然后通過翻譯后修飾化及位于內質網和高爾基體中的加工酶的作用，形成具有特殊生物功能的成熟多肽[27, 35]。另一個分泌型信號肽是富含半胱氨酸多肽，它的特點是在整個肽段中存在偶數個半胱氨酸(Cys)殘基并形成分子內二硫鍵。富含半胱氨酸多肽通常要比翻譯后修飾的小肽(少于160個氨基酸)大得多，帶正電荷，大約含4～16個半胱氨酸殘基。這些殘基對成熟肽的正確構象折疊是不可或缺的。與翻譯后修飾小肽不同的是，目前并沒有研究證實富含半胱氨酸多肽存在翻譯后修飾過程[28]。而與翻譯后修飾小肽類似的是，富含半胱氨酸多肽同樣包含一個保守的 N 端信號肽，通過分泌途徑引導多肽到達正確的細胞位置，并且它們C端的成熟肽段也高度保守[36-37]。

3 植物小分子肽的功能

3.1 翻譯后修飾小肽

全長mRNA前肽進入分泌通路后，N端疏水信號肽被信號肽酶剪切。翻譯后修飾小肽(PTM)和富含半胱氨酸多肽(Cys-rich peptides)會通過不同的途徑產生成熟的活性肽。到目前為止，在植物中發現，所有翻譯后修飾小肽都歷經三種翻譯后修飾方式的其中一種或多種：絡氨酸(Tyr)硫酸化(黃色)，脯氨酸(Pro)羥基化(紅色)和/或羥脯氨酸(Hyp)-阿拉伯糖基化(綠色)，激活從前體蛋白序列中裂解修飾的肽段，從而得到一個不超過20種氨基酸殘基的翻譯后修飾小肽(PTM)[23](圖1)。許多參與植物發育、防御反應、細胞識別和胞間通訊的肽家族都屬于這個亞家族[26]，這些肽作為信號分子被特定的受體感知。雖然PTM肽下游在分子和生理活動方面已經取得了進展，但具體的作用模式和調節機制尚不清楚。

圖1 翻譯后修飾小肽和富含半胱氨酸多肽的加工修飾過程[5]Fig.1 Processing and modification of post translationally modified small peptides and Cys-rich peptides[5]

C端編碼的多肽CEPs(C-terminally encoded peptides)，是由15個氨基酸殘基組成的肽段，其中有2～4個脯氨酸殘基可能被羥基化，從而影響細胞的生物活性[51-52]。擬南芥中CEP1的過表達導致根系生長停滯[51]，并且在蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)中發現CEP1的過表達或應用外源合成的CEP1均可抑制側根的形成，增強根瘤的形成，誘導根周期性的膨大[52-53]。CEP5表達水平的改變也會影響擬南芥在地上組織的生長發育[54]。此外，Tabata等[71]在擬南芥中發現了CEP基因的兩個受體EPR1和CEPR2。迄今為止，CEP多肽在序列、長度、結構和翻譯后修飾上的變化已經被鑒定，并且證明了通過CEP受體(CEPRs)控制氮(N)的需求信號，參與豆科植物的根瘤形成和側根發育[55]。

CLE[CLAVATA3 (CLV3)/胚胎周圍區域]家族是PTM 肽中研究最早且最深入的小分子肽[38]。在擬南芥中，CLV3肽通過維持莖頂端分生組織的干細胞數量，發揮調節莖頂端分生組織的作用。自從發現了CLV3基因，隨后在雙子葉植物、單子葉植物、苔蘚和藻類中也逐漸發現了CLE家族的存在，多項實驗證明該家族在植物的不同發育過程和特異性組織中發揮重要作用，包括莖頂端分生組織和根頂端分生組織的發育、種子發育、維管束形成、結節形成、胚胎和胚乳的發育、根系結構的調節以及形成層中的干細胞穩態的調控等方面[24, 39, 72]。此外，還發現CLE基因在植物應對環境刺激的反應中也發揮各種生物學作用[73]。更重要的是，CLE家族作為一種肽配體，與多種受體的關系也多種多樣，一個受體激酶可以作為不同肽的受體，一個肽也可以被不同的受體識別。例如，在韌皮部和鄰近細胞中表達的TDIF/CLE41/CLE44肽可被原形成層細胞質膜上的富含亮氨酸重復受體樣激酶(LRR-RKs)TDR/PXY受體識別，并調控原形成層細胞的生長發育[72]。實驗結果表明CLV1不僅是CLE2的受體，也是CLV3的受體，前者配體-受體模塊主要系統地調節豆科植物根瘤的數目，后者主要在莖頂端分生組織維持期間發揮功能[74-75]。

植物中發現的含硫酸酪氨酸1 (PSY1)肽是一種含有18個氨基酸殘基的糖肽，SY1和PSK在納摩爾濃度下促進細胞顯著增殖和擴張。擬南芥基因組中發現了2個編碼PSY1前體同源物的基因，它們在保守的PSY1結構域內具有顯著的相似性，并參與蛋白水解過程中堿性氨基酸殘基的調控[44]。近期研究發現PSYR1為PSY的受體，它們都可通過調節水楊酸鹽和茉莉酸鹽參與植物的防御反應[76-77]。再者，富含羥脯氨酸糖肽(HYPSYS)是由15～20個氨基酸組成并含有4～7個可能羥基化的前位殘基的另一種糖肽，主要存在于茄科植物中[78]。HYPSYS信號肽可以激活蛋白酶抑制劑，在防御昆蟲等食草動物方面發揮了重要作用。研究發現該信號肽在煙草中過度表達時，可以增強植物對棉蚜幼蟲的抗性[79]。此外，根生長因子(RGF/CLEL/GLV)肽段長為13～18個氨基酸，該成熟肽是通過具有C-端保守基序的前體蛋白進行蛋白水解裂解而產生[57, 80]。調控花序脫落的IDA(inflorescence deficient in abscission)也是一種多肽信號，在花器官中正向調節花器官脫落，它和另外5個同源基因IDA-like (IDLs)共同享有一個C端附近的保守區域，這個保守區域是一段很短的合成肽，功能與 IDA相似[56]。由此看來，信號肽在根的重力作用、根尖分生組織的維持，根毛、側根和芽的生長和發育，以及花序脫落、應對環境脅迫等方面都發揮著重要的作用[80-81]。

3.2 富含半胱氨酸多肽

富含半胱氨酸(Cys)的肽段，其特征是包含2～16個半胱氨酸殘基的功能結構域。富含半胱氨酸多肽通常不需要前體蛋白的水解過程，但也有例外。富含半胱氨酸肽的激活是在保守的半胱氨酸殘基之間形成二硫鍵時完成的，從而使肽具有活性構象[5](圖1)。但它們的肽段長度和原始蛋白序列在肽段和物種之間都存在很大的差異，每個富含半胱氨酸的肽類都有一個半胱氨酸殘基的數量特征和位點差異特征。位點差異會影響分子內二硫鍵的形成，對適當的類特異性次級折疊和生物活性至關重要[23](圖1)。實驗證明抗菌肽AMPs能夠減輕宿主的防御反應，同時會產生對病原體的持久抵抗。而大多數已發現的富含半胱氨酸的植物肽被認為在植物與微生物的相互作用中發揮著和抗菌肽相似的作用，并且已經從植物的根、葉、莖、花和種子中分離出來。

目前為止，植物防御素(PDFs)是研究最深入的富含半胱氨酸多肽，長度為5 kD，該信號肽的主要特征是由1個螺旋形和1個三股的環狀結構構成，并由4個二硫鍵穩定該結構[23, 82]。PDFs廣泛存在于單子葉和雙子葉植物中，屬于致病相關的蛋白家族。相關實驗認為多種PDFs的外源過表達增加了模式植物和多種作物對不同真菌和細菌的抗性[83]。PDFs的其他相關活性酶也被報道，包括胰蛋白酶、α-淀粉酶、蛋白質合成抑制劑和阻斷鈉通道因子。此外，研究表明一些PDFs似乎在花粉識別、非生物脅迫耐受和根生長抑制等方面也發揮著重要作用[83]。

其次，硫蛋白(THIONINs)存在于單子葉和雙子葉植物中，屬于PR13(pathogenesis-related 13)家族，它們對細菌、真菌、酵母、昆蟲幼蟲和哺乳動物細胞等均產生毒性[84]。環肽(cyclotides)是一種特殊類型的打結肽，其特征是具有頭尾環化主干的長約30個氨基酸殘基的肽段，因此是一種超穩定肽。環肽具有廣泛的活性，包括在真菌、細菌、病毒、昆蟲、軟體動物、藤壺和線蟲等體內抑制生物活性[23, 85]。類HEVIN肽是含有6～10個半胱氨酸殘基的4 kD幾丁質結合肽，來源于前體蛋白。目前為止，在單子葉和雙子葉植物中只檢測到少量的類HEVIN肽[86]。實驗證明類HEVIN肽的過表達導致植物對各種真菌和卵菌病原菌的抗性增強[87-88]。因此，基于其與幾丁質的結合能力，提出了它們在植物防御過程可能發揮重要的作用[89]。

另外，分子量約為5 kD快速堿化因子(RALF)肽段來自于前體蛋白的C末端，是利用質譜技術在煙草葉片中檢測到的。利用磷蛋白組學方法，野薔薇(RosamultifloraThunb.)RLK1類激酶(Cr-RLK1L)受體家族中的FER(feronia)被鑒定為RALF受體，隨后，提出了信號轉導通路的模型[90-91]。表皮模式因子(EPF)和與表皮模式因子類似的肽段(EPFL)，在C端成熟肽區包含6～8個保守的半胱氨酸殘基，長度約為45～76個氨基酸，由前蛋白衍生而來[23]。研究發現EPF/EPFL基因存在于苔蘚、單子葉植物和雙子葉植物中，體外過表達EPF1、EPF2、EPFL4和EPFL5均會抑制氣孔的發育[65-66]。相反，EPFL9 的過表達導致植物氣孔密度的增加，并且近期實驗證實EPFL9 參與了氣孔通路的光響應[36]。

4 CLE和RALF小分子肽的研究進展

4.1 CLE小分子肽的研究背景和研究進展

CLE(CLAVATA3/胚胎周圍區域)小肽作為翻譯后修飾小肽的代表，是近幾年植物信號肽中最熱門的研究課題之一，CLE基因編碼保守的C末端CLE基序的小分泌肽。成熟的CLE肽是CLE基序經過翻譯后修飾(如羥基化和糖基化)，而后從其前體蛋白中分離出來的一段小肽[73, 92-93](圖1)。CLE基序是一個包含14個左右的保守氨基酸殘基的序列(KRXVPXGPNPLHNR)，稱為CLE基序或CLE結構域，是許多植物細胞增殖和分化機制的重要調控因子[73, 94-95]。但也有報道指出CLE保守基序長度為12～13個氨基酸殘基[96]。

CLE信號肽廣泛存在于自然界中，其名稱最早起源于兩個家族成員：擬南芥的CLV3基因和玉米(Zeamays)的ESR基因家族[38, 96-97]。CLV3和ESR序列共享14個氨基酸殘基，是一段短而保守的蛋白質序列，它們的結構和功能相似但并不相關，ESR基因主要在玉米胚乳的胚芽周圍區域特異性表達，而CLV3主要控制莖尖分生組織中干細胞的命運[38, 98]。CLE保守結構域是CLE蛋白的功能域，因此含有CLV3 結構域的蛋白序列均被定義為CLE基因家族[38, 92, 99]，而CLE蛋白由N端信號肽SP(Signal Peptide)、C端CLE保守基序和中間的可變區域組成。SP是一種疏水信號肽，可變區(相對于CLE基序的N端)編碼的蛋白通常沒有特定功能，可以用其他基因的核苷酸代替，CLE保守基序是重要的功能結構域[41-42, 96]。分泌的信號肽就像激素一樣也被證明可以調節植物的生理反應，參與植物細胞間的交流[100-101]。多細胞生物的生長發育和環境應激反應都依賴于細胞間的通訊，所有生物都利用細胞表面的受體來感知來自自身、非自身或修飾自我的胞外信號[73, 102]。而肽信號分子的級聯就是以配體-受體的方式將信號從一個細胞傳遞到另一個細胞。然而，信號肽配體-受體結合并不僅僅是一對一的單一作用，肽通過不同的受體激活多個下游信號肽，受體也會根據不同的信號肽傳遞不同的信號。例如，CLE1發揮功能在很大程度上依賴于CLV1，CLE11不那么依賴，而CLE22完全不依賴，并利用CLV1以外的受體發揮作用，表明這些CLE在受體靶點上存在相當大的差異[103-104]。

近期一項研究首次表明，在植物孢囊線蟲(cystnematodes)和叢枝菌根(Arbuscularmycorrhiza,AM)中也發現了CLE基因家族，并且許多基因包含高度保守的CLE結構域[103-104]。Guo等從擬南芥孢囊線蟲中分離到一類新的CLE肽，其功能與CLE41和CLE44基因編碼的B型CLE肽TDIF(管胞元素分化抑制因子)相似，并且進一步證明了TDIF-TDR (TDIF受體)-WOX4通路促進原形成層分生組織的細胞增殖，參與調控甜菜孢囊線蟲的寄生關系[38, 42-43]。有證據表明，植物根組織中的線蟲病原體也分泌類似植物CLE肽的配體，它們將選定的寄主細胞修飾成多核取食位點，并在功能上模仿一種植物肽，參與胞間信號傳導，以達到寄生的目的。叢枝菌根在真菌與植物共生中起重要作用，主要促進菌根的發育，有利于植物根系更好地吸收養分[105-106]。

CLE信號肽也存在于多種植物中，一項研究表明在小立碗蘚(Physcomitrellapatens)中發現了15個CLE基因，隨后在擬南芥、水稻(OryzasativaL.)、楊樹(Populustrichocarpa)、大豆(Glycinemax)和其他多細胞植物中也逐步發現了CLE基因[105-108]。CLE家族在模式植物擬南芥中得到深入研究，32個基因成員可被分為A型和B型兩大類型，由于不同物種間的差異，如果將擬南芥的32個CLE成員和其他物種的CLE成員共同進行進化分析，分類情況可能會超過兩類[20]。由于CLV3發現最早，因此是A類型基因中研究最為深入和透徹的一個基因，在擬南芥中主要促進根尖分生組織和莖尖分生組織的細胞分化[19]。B類型中最具典型特征和功能的CLE基因有4個(CLE41/TDIF/CLE44/CLE46)，主要促進擬南芥維管束細胞增殖，延緩韌皮部和木質部細胞群分化，調節維管干細胞的穩態。大量研究證明CLE分泌的肽在各種植物的信號通路中起關鍵作用，如傷口反應、花粉不親和性，特別是在莖尖分生組織和根尖分生組織中維持干細胞群穩態期間發揮了重要作用[108-110](圖2)。此外，有少量研究發現小分子肽還參與植物應對非生物脅迫的過程。例如，擬南芥CLE25在維管組織中表達，并與BAM受體結合通過調控脫落酸的積累來誘導氣孔關閉，從而增強擬南芥對脫水脅迫的抵抗能力。因此CLE25-BAM通路可能在脫水反應中作為長距離信號分子之一發揮著重要的作用[106]。

可見，植物中CLE信號肽主要調控莖尖分生組織和根尖分生組織及器官在靜止中心(QC)周圍的干細胞數量和大小的穩定性，而植物干細胞的增殖分化是各種器官和組織的主要來源[93, 111]。因此，與植物激素類似，肽信號也是植物生長發育和應對生物和非生物脅迫的重要信號通路。

4.2 RALF小分子肽的研究背景和研究進展

RALF(快速堿化因子)是一種大小約為5 kD的小分子肽，首次在煙草葉片提取物中發現，能夠引起煙草細胞懸浮培養基的快速堿化，同時激活細胞內有絲分裂原活化蛋白激酶。隨著各個物種全基因組測序的基本完成，在多個物種中都發現有該基因的存在，最近在紫花苜蓿和番茄中也發現了RALF基因[60-61, 112]。快速堿化因子(RALFs)是植物界廣泛存在的富含半胱氨酸的多肽，盡管比翻譯后修飾小肽(CLE、CLV3和RGF等)更大，但它們仍然很小(小于160個氨基酸)[113]。獲得N端肽序列之后從煙草葉片文庫中分離出一個前體cDNA，該前體編碼了一個大小為115個氨基酸殘基的蛋白序列，其C端包含一個RALF保守結構域，而大小為49個氨基酸殘基的活性肽就是從保守的C端釋放出來的，N端信號肽序列也是相對保守的，中間序列基本沒有顯著特征。此外，C端保守結構域中含有豐富的半胱氨酸，通常含有4～6個半胱氨酸殘基，相鄰兩個殘基之間會形成分子內二硫鍵[28, 40]。

圖2 CLE在成熟擬南芥不同組織中的表達示意圖[23]Fig.2 The schematic representations of CLE expressed in the various tissues of a mature Arabidopsis plant[23]

通過對EST數據庫的檢索發現，RALF基因廣泛存在于雙子葉植物、單子葉植物和裸子植物中，如擬南芥、楊樹、甘蔗(Saccharumofficinarum)、番茄等其他茄科(Solanaceae)植物[28, 112, 114]。擬南芥中已經鑒定出了40個編碼RALF和RALF-like (RALFL)基因，并在不同器官和組織中表現出不同的表達模式[115](圖3)。研究表明，AtRALF1和AtRALF23在根中特異性表達，其在擬南芥中的過表達表現出幼苗的根細胞減小，生長緩慢[116-117]，另外的研究還發現了擬南芥的兩個受體BUPS1和BUPS2及其肽配體RALF4和RALF19均在花粉管中表達，參與花粉管的生長發育，維持花粉管的完整性，表明RALF4和RALF19的功能依賴于調控花粉表達的富亮氨酸重復擴增酶(LRX)蛋白，因此該蛋白在細胞壁的發育中也具有重要作用，但是其作用方式尚不清楚[117-118]。研究進一步證明，RALF4作為肽配體，其N端信號肽區域(包括YISY結構域)對其生物學功能至關重要，C端的保守功能域能夠與受體LLG結合，但與LLGs的作用較弱而與BUPS-ANX受體的相互作用較強[119]。其次，番茄的RALF基因也表現出花粉特異性表達，它在特定的發育期內抑制花粉管的伸長，但不影響花粉活力、水化或早期萌發[61, 112]。另外，前人從楊樹cDNA文庫中也分離到了兩種獨特的楊樹RALF肽的cDNAs：PtdRALF1和PtdRALF2。實驗研究表明，PtdRALF1在楊樹莖端、葉柄、葉、莖、根、芽、樹皮中都有不同程度的表達水平；相比之下，PtdRALF2在大多數組織中也都有表達，但在幼葉和成熟葉中卻幾乎沒有表達或者表達水平極低。然而，研究也顯示在外源茉莉酸甲酯(MeJa)處理后，楊樹體內的RALF表達量明顯降低，尤其是PtdRALF2[112]。

圖3 RALF在成熟擬南芥不同組織中的表達示意圖[122]Fig.3 The schematic representations of RALF expressed in the various tissues of a mature Arabidopsis plant[122]

此外，眾多的相關研究均發現，RALF作為一種小肽更可能參與植物的生長發育過程而不是防御反應。例如，RALF信號肽能抑制番茄植株的根系生長，但不能誘導抗草食動物蛋白酶抑制劑的產生[28]；其次，RALF肽在果實成熟的某一階段有中度甚至高度表達水平，但在防御信號通路的表達量并不顯著；最后，對含有生長調節劑的植物進行非生物脅迫處理后，這些基因的mRNA水平并無顯著變化[28, 114]。但是2013年的一項研究表明，AtRALFL8在根中被多重脅迫所誘導，但在擬南芥中過表達時，又增加了擬南芥在干旱脅迫和線蟲感染下的敏感性。因此，AtRALFL8的誘導說明植物通過不同激素信號通路使細胞發生復雜的生理變化，從而產生保護它們免受脅迫的生理機制[120]。該研究結果表明，在同時存在的生物和非生物脅迫的環境下，植物可以產生類似于AtRALFL8這樣的信號肽來誘導細胞壁重塑以應對多種外界壓力。這一實驗結果推翻了先前的RALF堿化因子僅參與植物生長發育而不是防御反應的結論。然而，最新的研究又發現，在病原體觸發植物免疫反應后，RALF23及其同源蛋白RALF33通過蛋白水解酶激活，從而抑制了植物的免疫反應[121]。由此得知，大量物種的RALF信號通路和基因功能都還沒有得到證實，本文的概述為未來快速堿化因子RALF的研究提供了一個重要的方向。

5 總結與展望

植物信號肽分子是一種小肽，作為信號分子，正如傳統植物激素一樣，往往起到“四兩撥千斤”的作用。多種植物小分子肽的研究表明，小分子肽是由前體蛋白加工而成的一種多肽，廣泛存在于多種植物中，包括裸子植物、單子葉植物、雙子葉植物、苔蘚和藻類等植物，并且在植物的多種器官中都有不同水平的表達，參與了植物生長發育等許多生物學過程，說明它們在植物體內具有重要的調控作用。雖然植物信號肽的研究已經取得一些進展，但由于功能肽段很短，在植物體內的表達水平極低，因此該方面研究仍具有巨大的挑戰。近10 年來，各種組學技術日新月異，尤其是近年來基因組和轉錄組學相關研究已從模式植物擬南芥、水稻等成功延伸到各種經濟作物。越來越多的已知植物信號肽激素的同源物被發現和鑒定，特別是一些物種特異性和環境適應性的信號肽也得到進一步發掘和鑒定。但是如何驗證眾多的小分子肽的生物學功能并在生產中充分利用是未來研究的一個重要方向和巨大挑戰。植物小肽是一個極具前景的研究領域，但其數量多、生物學功能研究難度大，加上目前植物小分子肽的研究技術手段也還不夠成熟，給植物小分子肽的研究增加了難度，但同時也為植物多肽的研究提供了更大的契機。如若將小分子肽成功應用到生產中，就可以減少農藥化肥等的施用量，起到減肥增效的效果，還能提高經濟作物和糧食作物的產量和品質。