基于網絡藥理學探討菟絲子、女貞子治療絕經后骨質疏松癥的作用機制

李慧文，曾令烽，陳海云

(1.廣州中醫藥大學第二臨床醫學院，廣州 510405； 2.廣東省中醫院骨傷科，廣州 510120)

骨質疏松癥是一種常見病，其主要病因是骨骼中骨量低，骨微結構損壞，無法保證骨骼韌性與強度，從而導致骨骼脆性增加[1]。在原發性骨質疏松癥中，絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)發病率最高，對絕經后婦女的健康構成嚴重威脅，且對患者的日常生活造成極大影響[2]。PMOP與祖國醫學中“骨枯”描述癥狀十分相似。《靈樞·經脈》：“足少陰而氣絕，則骨枯已”。腎精虧虛，骨髓化生無源，無以滋養骨骼，枯槁易折。PMOP的辨證主要分為腎虛血瘀、脾腎兩虛、肝腎陰虛和腎精虧虛4型[3]。由此可見，此病以肝脾虛和腎虛為主，同時伴有血瘀癥，治療上應以補腎填精為主，兼以活血化瘀、健脾益氣養陰。

中醫藥治療PMOP收效良好，既能減輕癥狀，又能改善患者的整體狀態，且無明顯毒副作用。菟絲子和女貞子是常用的藥對。菟絲子黃酮具有促進機體產生內源性雌激素的作用，女貞子提取物中也存在雌激素樣物質[4]，因而兩者配伍治療PMOP常事半功倍。本研究通過網絡藥理學探討菟絲子、女貞子中有實際價值的活性成分、作用靶點及其相互作用，進一步預測菟絲子、女貞子抗PMOP的靶點，重點研究菟絲子、女貞子配伍治療PMOP的可能作用機制。

1 資料與方法

1.1菟絲子、女貞子的潛在活性成分及作用靶標收集 以“TUSIZI”“NVZHENZI”為檢索詞，生物利用度≥30%、類藥性≥0.18為篩選條件，在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)中檢索獲得菟絲子、女貞子的相關活性成分。

1.2菟絲子、女貞子作用靶標收集 從PubChem平臺(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得菟絲子和女貞子具體活性成分對應的化學結構，并對其進行smiles格式調整。然后對其進行整理并導入Swiss Target Predictio平臺(http://www.swisstargetprediction.ch/)進行藥物活性成分靶標預測，物種選擇“Homo Sapiens”。

1.3PMOP靶標收集 以“postmenopausal osteoporosis”為關鍵詞，從人類孟德爾遺傳數據庫(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)、GeneCards數據庫中收集PMOP有關的靶標。將UniPort數據庫作為基礎，完成確認、轉換等步驟。對以上靶標進行整合，剔除其中的重復項和假陽性靶標，再通過Venny平臺(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)完成藥物相應的靶標及疾病關鍵靶標的映射，進而明確菟絲子、女貞子有效的活性成分并繪制韋恩圖。

1.4藥物-活性成分-疾病-關鍵靶標可視化網絡的構建 經映射獲得疾病、關鍵靶標以及活性成分間的關系，并通過Cytoscape V3.7.2中的自由度、介度與緊密度等對特征值進行拓撲，進而展開可視化分析，完成對藥物-活性成分-疾病-關鍵靶標網絡的建立。

1.5關鍵靶標蛋白質互作網絡(protein-protein interaction network，PPI)的構建 在String v 11.0中錄入關鍵靶標并進行物種設置，設成“Homo Sapiens”，即可實現對PPI網絡的有效建立。然后在Cytoscape內導入所涉各項數據，并基于可視化分析的相關過程完成對PPI網絡圖的建立。

1.6菟絲子、女貞子作用靶標和關鍵靶蛋白可靠性驗證及分子對接 本研究選取藥物作用靶標的三維結構作為對接所用的蛋白，從RCSB Protein Data Bank平臺(https://bivi.co/visualisation/rcsb-protein-data-bank)下載菟絲子、女貞子作用靶標的三維結構，以ChemBio3D Ultra 17.0完成對靶蛋白三維結構的可視化處理，然后通過MMFF94力場完成相關調整。蛋白、化合物均通過AutodockTools 1.5.6將格式轉化為PDBQT格式。通過Autodock vina 1.1.2[5]完成分子對接處理，并將參數exhaustiveness調整為20，選擇優質的構象后使用Pymol軟件顯示其三維結構。

1.7關鍵靶標生物功能注釋及通路分析富集 使用R 4.0.5進行基因本體(Gene Ontology,GO)和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)分析，GO富集對生物過程、細胞組成、分子功能進行分析，通路分析選擇KEGG，設置校正后的P<0.05，并繪圖。

2 結 果

2.1菟絲子、女貞子的潛在活性成分篩選 以生物利用度≥30%、類藥性≥0.18作為篩選標準，于TCMSP數據庫內完成篩選，共獲得菟絲子潛在活性成分11個，女貞子潛在活性成分13個，見表1。

表1 菟絲子、女貞子的潛在活性成分

續表1

2.2菟絲子、女貞子配伍治療PMOP的潛在作用靶標預測 完成菟絲子、女貞子潛在活性成分篩選后，將其smiles格式向Swiss Target Prediction平臺中進行轉移，共獲得兩植物的潛在作用靶標572個，其中菟絲子282個，女貞子290個。排除重復靶標后，菟絲子靶標共190個，女貞子則降至170個。基于OMIM與GeneCards數據庫，疾病靶標共1 296個，對其進行重復靶標排除后梳理出不同的疾病靶標共1 130個。通過Venny平臺繪制韋恩圖(圖1) ，經映射處理后，篩選出疾病、藥物同時作用的靶點共113個，菟絲子起作用的靶標107個，而歸屬女貞子的104個，兩者共同靶標98個。對應的活性成分共18個，其中菟絲子10個，女貞子8個。

2.3藥物-活性成分-疾病-關鍵靶標可視化網絡構建及分析 將菟絲子、女貞子與PMOP共同的靶標及相關活性成分等信息添加到Cytoscape中，進一步建立與繪制藥物、活性成分-疾病-關鍵靶標之間可視化網絡，見圖2。與關鍵靶標存在直接相關性的活性成分共15個，其中12個活性成分能與3個以上的關鍵靶標相連，包括芝麻素、異鼠李素、β谷甾醇、山柰酚、異黃酮、苦參堿、膽固醇、槲皮素、女貞果苷D_qt、紫杉醇、木犀草素、圣草酚。關鍵靶標中度值前5的分別為前列腺素內過氧化物合成酶(prostaglandin-endoperoxide synthase，PTGS)1、PTGS2、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferative activated receptor γ,PPARγ)、核因子κB p65(nuclear factor κB p65,RELA)、胱天蛋白酶3(caspase-3)。

2.4關鍵靶標PPI網絡 于String數據庫中獲取蛋白質間的互作關系，再將相關數據添加到Cytoscape中，完成對蛋白質互作網絡圖的繪制，蛋白質互作網絡圖見圖3。其中含關鍵靶標113個，條邊共17 030個。Degree值排名前10的分別是JUN、RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(RAC-α serine/threonine-protein kinase,AKT1)、促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)1、白細胞介素(interleukin,IL)-6、RELA、MAPK8、MAPK14、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、雌激素受體1(estrogen receptor 1,ESR1)、血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)。

節點大小采用以Degree值表示，節點隨值增大而增大；Combine socre值的大小反映邊的粗細，Combine socre值越大，邊越粗

2.5菟絲子、女貞子作用靶標和關鍵靶蛋白分子對接可靠性驗證及結果 通過分子水平描述化合物β谷甾醇、異鼠李素、山柰酚、木犀草素、槲皮素與PTGS1、PTGS2、PPARγ、RELA、caspase-3的作用模式，將上述成分進行分子對接，其親和力見表2，并取得分最高的β谷甾醇和PPARγ作圖分析，其理論結合模式見圖4～7。

PPARγ：過氧化物酶體增殖物激活受體γ

表2 使用分子對接軟件Autodock Vina進行對接打分 (kcal/mol)

2.6關鍵靶標生物的功能注釋及通路分析 經GO功能相關注釋顯示，菟絲子和女貞子存在關鍵靶標的主要功能為DNA結合轉錄因子結合、RNA聚合酶Ⅱ特異性等，見圖8。通過對KEGG通路富集分析結果顯示，篩選出主要的富集通路有糖尿病并發癥的晚期糖基化終末產物-晚期糖基化終末產物受體信號通路、流體剪切應力以及動脈粥樣硬化信號通路、IL-17信號通路、腫瘤壞死因子信號通路等，見圖9。

PPARγ：過氧化物酶體增殖物激活受體γ

紫色箭頭：氫鍵方向 PPARγ：過氧化物酶體增殖物激活受體γ

紫色：蛋白；藍色：配體 PPARγ：過氧化物酶體增殖物激活受體γ

圖8 菟絲子和女貞子關鍵靶標的生物功能注釋富集分析

KEGG：京都基因和基因組百科全書

3 討 論

女性在絕經期后雌激素水平顯著下降，導致身體骨鈣含量大量流失，出現骨質疏松，西醫治療以預防骨質丟失、抑制骨吸收為主，并不能從根本上改善骨代謝情況，且存在一定的不良反應[6]。而中藥治療PMOP的效果顯著、無毒副作用的優點而被大多數PMOP患者所接受。

《開寶本草》言：“菟絲子味辛、甘、平，無毒……強陰，堅筋骨?！币嘤形墨I佐證菟絲子藥用成分，菟絲子黃酮可抑制去卵巢骨質疏松大鼠的骨代謝，還可調節骨產生與骨吸收的關系，加快機體雌激素的生成速度，從而預防雌激素降低引發的骨質疏松癥[7-8]。《本草新編》云：“女貞子味苦、甘，氣平，無毒，入腎經……壯筋強力?！爆F代藥理研究證明，女貞子提取物可有效抑制破骨細胞的分化以及骨吸收功能，調節成骨細胞的增殖，從而進一步預防骨質流失[9]。無論是祖國醫學還是現代醫學，菟絲子和女貞子在治療骨質疏松癥方面均有良好的療效。菟絲子偏溫，女貞子偏涼，兩者合用可發揮平補的作用，而菟絲子填腎精，女貞子滋腎陰，兩者合用，補益肝腎，填精益髓，能有效緩解PMOP患者腰膝酸軟、周身骨痛、潮熱盜汗的癥狀。若患者出現脾腎陽虛腹瀉時則應考慮去女貞子，加用溫陽藥物(如鹿茸、淫羊藿、附子、肉桂)進行治療。

本研究使用PPI網絡篩選出菟絲子、女貞子配伍治療PMOP關聯度最高的基因包括JUN、AKT1、MAPK1、IL-6、RELA、MAPK8、MAPK14、EGFR、ESR1、VEGFA等。在PMOP的發病過程中，破骨細胞破壞骨質，而IL-6是重要的破骨細胞調節因子之一[10-11]，可與腫瘤壞死因子-α等細胞因子協同調控細胞炎癥反應，并與IL-17信號通路密切相關。臨床上PMOP患者血清中IL-6和腫瘤壞死因子-α水平多有升高。AKT1參與調控細胞增殖和生長，與成骨細胞相關，可調控骨形成的速度[12]。在骨形成與血管生成偶聯機制中，成骨細胞及其前體細胞可通過分泌VEGF相關細胞因子(如VEGFA)參與骨血管生成的調控，還可參與骨生成及骨重建[13]。體外實驗證明，EGF可以激活破骨細胞，加快骨吸收的速度，還可抑制成骨細胞[14]，與EGFR共同參與成骨破骨的過程。JUN蛋白能與Fos家族內的蛋白發生聚合反應并變成異源二聚體，從而擔負起轉錄因子角色，發揮促進骨細胞凋亡的作用[11]。研究表明，JUN蛋白包含c-Jun、JunB、JunD，三者可以兩兩結合形成同源二聚體，也可以與Fos家族的蛋白形成異源二聚體，從而發揮轉錄因子的作用，參與調節骨質疏松癥中成骨細胞的凋亡[15]。

本研究通過KEGG富集研究顯示，菟絲子、女貞子可以通過糖尿病并發癥晚期糖基化終末產物-晚期糖基化終末產物受體通路作用于IL-1、IL-6、IL-8、caspase-3等靶點，從而達到有效治療PMOP的目的。研究表明，2型糖尿病與維生素D之間存在密切聯系，糖代謝與骨代謝之間也存在緊密關聯，胰島素拮抗程度越高，發生骨質疏松癥的可能性越大[16-17]；相關研究指出，菟絲子、女貞子均具有抗炎、抗氧化、抗骨質疏松、控制血糖的作用[18-19]。骨質疏松癥與頸動脈硬化均是絕經后婦女的常見病,有大型流行病學研究提示骨質疏松癥與頸動脈硬化顯著相關[20]。還有研究顯示，PMOP患者血清IL-17水平高于絕經后骨質正常和骨量降低的患者[21]。

破骨細胞在破骨過程中打開微小的孔洞，然后再被成骨細胞填滿，其中重要的鑿孔分子是超氧自由基(·O2-)[22]。研究發現菟絲子和女貞子均有清除氧自由基的作用[23]。缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)對破骨細胞的形成有促進作用，且能顯著提高破骨細胞活性[24-26]。動物實驗研究表明，去卵單小鼠破骨細胞內HIF-1α水平升高，骨代謝破骨指標Ⅰ型膠原交聯C端肽(C-terminal telopeptide of collagen type 1,CTX-1)也升高，導致骨質疏松癥，若給予去卵巢小鼠HIF-1α抑制劑2-甲氧雌二醇，則破骨細胞內的HIF-1α水平較前下降，同時骨代謝破骨指標CTX-1也較前下降，骨質疏松程度有效減輕[25]。表明HIF-1α參與PMOP相關過程，可加重骨質疏松程度。對去卵巢小鼠給予HIF-1α抑制劑后，其骨代謝指標CTX-1開始出現下降，破骨細胞活性被抑制，減少骨質疏松癥的發生。因此，結合臨床及現代藥理學推測菟絲子、女貞子配伍可能通過抗氧化抑制破骨細胞骨吸收作用達到抗PMOP的目的。另外，本研究KEGG通路結果顯示，部分通路之間存在協同作用，如調控成骨細胞的HIF-1通路，使VEGF和其他血管發生相關因子過表達，可促進骨血管生成和骨形成[27]。以往研究證實，Hippo信號通路與骨代謝密切相關，而骨代謝的穩定是在成骨細胞與破骨細胞的骨吸收-形成平衡的基礎上實現[28]。Hippo-YAP信號通路是目前研究的熱點，補腎中藥通過該通路治療骨質疏松癥的作用機制仍需進一步研究完善。

綜上所述，菟絲子、女貞子可通過不同的信號通路抑制破骨細胞分化及活性，減少骨質流失，促進成骨細胞分化和活性，以及類激素作用，從而達到治療PMOP的目的。但是菟絲子、女貞子對腸鈣吸收是否有促進作用尚未得到證實，仍需要進行更深入的實驗探究，從而明確菟絲子和女貞子有效活性成分作用的基因或蛋白，為治療絕經后骨質疏松癥提供新的思路。