銀杏內生鏈格孢菌培養條件初探*

莊 華

（1.陜西省土地工程建設集團有限責任公司，陜西 西安 710075；2.陜西省土地工程技術研究院有限責任公司，陜西 西安710021；3.自然資源部退化及未利用土地整治工程重點實驗室，陜西 西安 710075；4.陜西省土地整治工程技術研究中心，陜西 西安 710075；5.陜西地建土地工程質量檢測有限責任公司，陜西 西安 710082）

植物內生真菌是與植物組織共生的一類真菌，它們可以產生與宿主類似的且具有生理活性的代謝產物[1]。近年來隨著銀杏栽培規模擴大，銀杏葉部病害的發生日趨嚴重，而內生鏈格孢菌是銀杏葉部重要的內生真菌之一[2-3]。本實驗初步探索不同營養、光照、pH值等培養條件下對鏈格孢菌菌絲生長和產孢量的影響，為進一步研究銀杏鏈格孢菌奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

銀杏鏈格孢菌來自本實驗室，實驗前進行活化[4-5]。

1.1.2 供試植物

小麥、青稞、十大功勞和銀杏新鮮葉片。

1.1.3 PSA培養基

按文獻[3-4]的方法配制：胡蘿卜（去皮）200g，蔗糖20g，瓊脂20g，水1000mL。具體制作方法是：將200g胡蘿卜切成小條放入鋁鍋中，加入1000mL水，煮沸20～30min左右至胡蘿卜軟而不爛時，用6～8層紗布過濾，取濾汁于鍋中，補水至1000mL，加入瓊脂熔化，再加入糖攪拌均勻，趁熱分裝于試管中。

1.2 方法

1.2.1 接種培養及菌餅的制作

按文獻[4-5]的方法進行。在恒溫培養箱25℃培養60h～72h。當菌絲體布滿培養皿后，在無菌條件下取直徑為7mm菌餅。

1.2.2 含不同植物葉片汁液的培養基制備及其對菌落生長的影響測定

分別稱取3-5g小麥、青稞、十大功勞和銀杏的新鮮葉片，切碎對應放入500ml三角瓶中，再分別加入200ml蒸餾水，將三角瓶在微波爐加熱煮沸約30min，待冷卻后，用紗布過濾至三角瓶中，并稱取瓊脂粉3.5g，搖勻后加熱至瓊脂完全溶后定容，用三角瓶分成2份，一份加庶糖2g為一組，一份為不加蔗糖為一組。分別將菌餅接種到制備的2種不同處理培養基中，每組做6個重復，放置在25℃培養箱中培養72h后，量取菌落直徑并計算菌絲生長速率[4]觀察并記錄菌落生長。

1.2.3 不同光照條件設定及對菌絲生長和孢子萌發的影響測定

接種的菌餅分別在直射光下、散射光下、黑暗條件下25℃培養，48h后量取菌落直徑，每組做6個重復。凹玻片懸滴法檢測孢子萌發：用無菌水將培養物制成孢子懸浮液，在XSP-2CB雙模顯微鏡（10×10）下觀察孢子濃度后，放置在25℃培養箱中，相對濕度90%-100%的條件下培養12h后統計分生孢子的萌發率，每組做6個重復。

1.2.4 不同pH值培養基制備及對菌絲生長和孢子萌發的影響測定

PSA培養基滅菌后待60℃-70℃時，測量其pH值后，相應的用0.1mol/L HCl或0.1mol/L NaOH溶液調pH梯度分別為2～13，迅速倒皿，待其凝固后把菌餅分別接到制備的不同pH值培養基上，在25℃下培養72h后測量并記錄菌落直徑，每組做6個重復。按1.2.3中配制孢子懸浮液，pH調節到2～13的不同pH值梯度，采用凹玻片懸滴法，將培養物放在25℃培養箱中培養12h，統計分生孢子的萌發率，每組做6個重復。

2 結果與分析

2.1 含不同植物葉片汁液的培養基對菌絲生長和產孢的影響

含不同植物葉片汁液培養基培養的銀杏鏈格孢菌的生長特性見表1。實驗發現沒有加糖處理的菌落生長表現為菌絲體稀疏,同時，菌落的直徑偏小且產孢量也較少，而加糖的菌絲密度呈現出密集狀態,表現為絮狀。顯而易見，糖分對鏈格孢菌菌絲體生長及分生孢子的產生具有促進作用。從表1結果可知,以含小麥、青稞、十大功勞等植物葉片汁液培養基的生長較差,而含銀杏葉片汁液培養基的生長情況明顯比前面幾種植物好，這也說明該菌在銀杏中寄生更加適合，由此說明，銀杏鏈格孢菌對培養基中不同營養成分具有一定的選擇性或適應性。

表1 鏈格孢菌在含不同植物葉片汁液培養基上的生長特性

2.2 不同光照條件對菌絲生長和孢子萌發的影響

不同光照條件下處理后，菌絲體在散射光、黑暗條件下生長及孢子萌發優于直射光處理。日平均生長速率和分生孢子萌發率結果見表2、表3。

表2 菌絲體在不同光照條件下的日平均生長速率

表3 分生孢子在不同光照條件下的萌發率

2.3 不同pH值對菌絲生長和孢子萌發的影響

pH值在5～9范圍時，菌絲體生長表現最適宜，當pH值為5時生長明顯增快，70～72h后菌落直徑42.5～47.3mm，全皿可見；當pH值為2時，發現只有在菌餅上有菌落。當pH值為10～12范圍時，菌絲生長較緩慢，72h后迅速生長，試驗結果見表4。

表4 菌絲體在不同pH值下的生長速率及孢子萌發率

3 討論

研究發現不同的培養條件對銀杏鏈格孢菌菌絲生長及孢子萌發有著很大差異，溫度、濕度和光照等培養條件影響其生長和繁殖[6-8]，菌絲體生長速率及孢子萌發率在直射光條件下弱于在散射光和黑暗條件下，這可能是菌絲體在生長過程中直射光光源太強，抑制了菌絲體的生長。同時，有學者研究發現內生真菌可能會產生酸性代謝產物而降低了培養基的pH值[9-10]。含不同植物的汁液培養基對銀杏鏈格孢菌的生長明顯有差異，但都能產生菌絲體，說明銀杏鏈格孢菌的營養范圍比較廣泛。了解內生真菌的基本生長特性很有必要，本研究旨在為進一步研究銀杏鏈格孢菌奠定基礎。同時，為深入挖掘內生真菌的資源利用提供重要技術支撐。