循環miRNA作為冠心病潛在生物標志物的研究進展

劉月娥 關秀茹

(哈爾濱醫科大學附屬第一醫院檢驗科，黑龍江 哈爾濱 150001)

冠心病是世界上最常見的心血管疾病之一，是一種主要由動脈粥樣硬化引起的慢性病，許多研究揭示了冠心病的發病機制，但冠心病的死亡人數仍在逐年增加[1]。醫療技術的不斷進步也使得冠心病的診斷方法不斷完善，但仍存在一定的局限性，因此冠心病的早期診斷和有效預防在整個醫學界面臨著重大的挑戰[2-3]。近年來非侵入性生物標志物miRNA的發現為冠心病的預測和診斷提供了強有力的手段，從而有助于臨床醫生盡早為冠心病患者提供最佳的預防和治療措施。

1 冠心病的概述

1.1 冠心病的定義

冠心病是一種主要由動脈粥樣硬化引起的慢性炎癥性疾病，是由于動脈粥樣硬化斑塊引起血管狹窄所致的心肌缺血，從而導致臨床上的一系列癥狀[4]。臨床上主要分為穩定型心絞痛(stable angina pectoris，SAP)和急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)，ACS主要包括不穩定型心絞痛(unstable angina pectoris，UAP)、非ST段抬高心肌梗死(non-ST segment elevation myocardial infarction，NSTEMI)和ST段抬高心肌梗死(ST segment elevation myocardial infarction，STEMI)[5]。盡管醫療技術在不斷地進步，但冠心病仍是發達國家和發展中國家的主要死亡原因，并給人類帶來嚴重的社會經濟負擔[6]。

1.2 冠心病診斷方法的不足

冠狀動脈造影(coronary angiography，CAG)是診斷冠心病的金標準，但操作方法有創、繁瑣且成本昂貴，檢測范圍主要在疾病的末期，如多個血管受到影響或多處動脈狹窄，CAG很難進行[2]。此外，目前應用最廣泛的診斷冠心病的傳統生物標志物，如超敏C反應蛋白(hs-CRP)、肌酸激酶MB(CK-MB)、腦鈉肽(BNP)、高敏肌鈣蛋白T/I(hs-TnT/hs-TnI)和白細胞計數等，它們不僅受到年齡、遺傳背景、心臟相關疾病、藥物和生活方式的混雜影響，且特異性不高，不能用于疾病的早期診斷，也不能預測冠心病的未來并發癥[3]。

2 miRNA的概述

成熟miRNA是一種存在于所有真核生物中的由18～25個氨基酸組成的非編碼短鏈RNA[7]。miRNA前體通過特定的核糖核酸酶將莖環和末端環依次切割形成成熟的miRNA。大多數物種的miRNA都具有高度精確的末端，因此miRNA可通過與靶mRNA的3’非翻譯區(UTR)末端完全或部分互補結合，調節轉錄后基因表達，不僅可誘導mRNA切割和抑制mRNA翻譯，且可通過去烯基化、去帽和核外消化機制促使mRNA降解，從而降低蛋白的表達[8]。在某些情況下，miRNA也可增強基因的轉錄或mRNA的翻譯，從而提高蛋白質產物的水平[9]。

miRNA一直是備受關注的話題，已有研究表明miRNA在發育時間、細胞分化、胚胎發生、新陳代謝、器官發生和凋亡等許多生物學功能中發揮著重要的作用[10]，且它們的異常表達參與許多疾病的發生與發展，包括心血管疾病、代謝性疾病、癌癥和病毒的感染等[11]。其中，循環miRNA在體液中具有許多優勢，成為許多疾病很有前途的治療和診斷工具，并有望成為潛在的生物標志物[12-13]。

3 循環miRNA作為潛在生物標志物的優點

循環miRNA作為生物標志物具有許多優點，與冠心病的傳統生物標志物相比，循環miRNA不僅在體液中穩定存在，表達量在年齡、性別或采樣時間之間的差異較小，且檢測方法快速、簡單、靈敏和經濟[3，14]。此外，循環miRNA在大多數體液臨床標本中表達豐富，比傳統的生物標志物更早地被檢測到，且具有較高的組織類型、疾病狀態特異性和敏感性[1，12]。與確診冠心病金標準的CAG相比，循環miRNA具有無創、方便和成本低廉的優點[2]。

4 循環miRNA作為冠心病潛在生物標志物的臨床應用研究

4.1 冠心病的早期診斷

冠心病在早期一般無任何癥狀，很難被發現，但冠心病的預測和早期診斷可使臨床醫生對患者進行危險分層，以便選擇和決定合適的治療方案，從而減輕冠狀動脈并發癥的發生[15]。目前，已有多種研究表明循環miRNA可能是冠心病預測和早期診斷的新型生物標志物。

Kumar等[16]將受試者分為冠心病、動脈粥樣硬化前正常冠狀動脈(normal coronary artery，NCA)及健康受試者三組，結果顯示循環miR-133b和miR-21在NCA、SAP和ACS患者血漿中的表達水平較健康受試者顯著下調或上調，并隨疾病的不斷進展逐漸降低或增高。由于循環miR-133b和miR-21在動脈粥樣硬化前狀態即可發生顯著變化，因此可能作為冠心病早期診斷的潛在生物標志物。也有研究發現無保護左主干病變(unprotected left main coronary artery disease，uLMCAD)患者血漿中高表達的miR-182-5p和低表達的miR-5187-5p都有可能在有創診斷性CAG前區分uLMCAD患者和非冠狀動脈疾病(coronary artery disease，CAD)對照組。因此，血漿miR-182-5p和miR-5187-5p有望成為uLMCAD患者早期診斷的合適生物標志物[17]。

更為重要的是，一些循環miRNA在冠心病早期與傳統的標志物相比，能更早地診斷冠心病。Li等[18]發現，急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)患者早期血漿中miR-22-5p和miR-150-3p的水平顯著升高，表達高峰早于心臟肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)；相反，循環miR-132-5p在AMI早期維持在低水平。且受試者操作特性曲線分析顯示這三種miRNA組合與任何單一miRNA相比，區分AMI與對照組的能力顯著提高。Bialek等[19]的研究也證實該結論，他們的結果顯示STEMI患者入院時，血漿miR-208a水平顯著升高，3 h達到高峰，較心肌梗死傳統的生物標志物cTnI和CK-MB出現得更早，達高峰的時間更早。

4.2 冠心病的鑒別診斷

循環miRNA可用來區分冠心病與非冠心病患者，Bukauskas等[20]發現在心肌梗死后的前24 h內，STEMI患者血清中低表達的miR-30d-5p、miR-146a-5p和miR-23a-3p對STEMI患者與健康對照者具有一定的區分能力[受試者操作特征曲線下面積(area under the curve，AUC)值分別為0.745、0.800和0.806]。類似的，血漿中上調的miR-126-5p、miR-20a-5p、miR-22-3p、miR-29a-3p、miR-30e-5p和miR-93-5p以及下調的miR-3184-3p和miR-671-3p均可區分冠心病與NCA患者(AUC值均>0.700)[21]。Horvath等[22]也報道STEMI患者血漿中高表達的miR-151-3p和miR-331能顯著區分STEMI患者和對照組，AUC值均>0.750，但這兩種miRNA的組合并不能提高診斷性能。

由于單一的循環miRNA對冠心病診斷的特異性和敏感性較低，因此多種循環miRNA的組合被許多學者提出。Nariman-Saleh-Fam等[23]的研究結果顯示外周血單核細胞中的miR-25、miR-21和PETN基因這三種指標組合起來與任何單一指標相比，區分冠心病與其他各組之間的能力提高5%～28%。Zhang等[24]發現，嚴重冠心病患者血漿中高表達的let-7i-5p、miR-26a-5p、miR-32-3p和miR-3149對診斷嚴重冠心病患者具有較高的特異性和敏感性，它們的AUC值分別為0.634、0.745、0.795和0.818，且這四個miRNA的組合與任何一個miRNA相比，顯示出更好的診斷性能(AUC值為0.837)。此外，另一項研究也證實，高表達的循環miR-29a-3p、miR-574-3p和miR-574-5p對冠心病具有較高的診斷能力(AUC值分別為0.830、0.792和0.789)，且它們的組合將使診斷能力提高8%～13%[25]。因此，多種miRNA的組合將顯著提高對冠心病的診斷性能，有望成為未來研究的新方向。

4.3 冠心病嚴重程度的評估

冠心病的嚴重程度與死亡率密切相關，因此冠心病嚴重程度的評估是至關重要的[26]。許多研究表明，冠心病經CAG后，常使用Gensini評分(Gensini score，GS)、SYNTAX評分(SYNTAX score，SS)及急性生理學和慢性健康狀況評價Ⅱ(Acute Physiology And Chronic Health EvaluationⅡ，APACHEⅡ)評分評估冠心病的嚴重程度和復雜性，從而更好地預測經皮冠脈介入術(percutaneous coronary intervention，PCI)和冠狀動脈旁路移植術的心血管風險和預后[20，27]。

Bukauskas等[20]研究表明，STEMI患者血清中miR-23a-3p的表達水平與APACHE評分呈負相關。Wang等[26]發現SS>32(高SS)組血漿miR-208b和miR-499水平明顯高于SS≤22(低SS)組和22

4.4 作為冠心病預后的標志物

miRNA被認為是心血管疾病，特別是冠心病潛在的診斷性生物標志物。但很少有研究對未來心血管事件的風險分層進行分析。近年來有些研究表明一些循環miRNA可作為冠心病風險評估和預后的生物標志物[32]。

一方面，循環miRNA可能是冠心病風險評估的有價值的生物標志物。Bukauskas等[20]發現，STEMI患者血清中miR-23a-3p的下調與全球急性冠狀動脈事件注冊(GRACE)死亡率風險評分呈顯著的負相關，但Kaplan-Meier生存曲線預測和Cox回歸分析顯示，miR-23a-3p可能只對STEMI患者提供有限的短期預后價值。同樣的，Mayer等[33]通過對冠心病患者的前瞻性研究發現，在穩定的慢性冠狀動脈疾病患者中，miR-19a的低表達與獨立于其他傳統心血管危險因素的死亡風險顯著增加相關。此外，一項對冠心病患者進行的6年隨訪研究也證實，血清中較高的miR-423-3p水平可顯著提高經典心血管危險因素對冠心病的預測能力[34]。

另一方面，循環miRNA可用來預測冠心病患者的主要心血管不良事件(major adverse cardiovascular events，MACEs)、死亡率、冠狀動脈狹窄進展和再狹窄。He等[35]的研究表明，ACS患者血漿中miR-21的表達水平越高，斑塊越不穩定，發生急性心血管事件的風險越高。Tang等[36]發現，在接受PCI的使用阿司匹林和氯吡格雷的雙重抗血小板治療的冠心病患者中，高血漿miR-142水平與MACEs的顯著高風險相關。同樣的，Kim等[37]的一項meta分析證實，循環miR-133a、miR-208b、miR-126、miR-197、miR-223和miR-122-5p的高表達與高死亡率相關，而循環miR-208b、miR-499-5p、miR-134、miR-328和miR-34a的高表達與MACEs有關。此外，有研究報道，經PCI并植入藥物洗脫支架的冠心病患者血漿中let-7f、miR-19a、miR-210和miR-296的水平與快速血管造影狹窄進展(rapid angiographic stenotic progression，RASP)風險降低獨立相關，而血漿中miR-19a、miR-126、miR-210和miR-378與再狹窄風險降低獨立相關[38]。以上研究雖未進一步證實循環miRNA與冠心病患者MACEs、死亡率以及冠狀動脈狹窄的因果關系，但現階段依然可通過檢測循環血中某些特定miRNA的水平，對冠心病患者進行早期預測。本文所選擇的對冠心病有診斷及預后作用的各種循環miRNA的總結見表1。

5 總結及展望

循環miRNA在體液中具有穩定存在和表達豐富的優點，有望成為冠心病潛在的新型生物標志物，從而有助于冠心病患者的早期診斷、鑒別診斷、嚴重程度以及預后的評估，但在臨床上的應用仍受到許多限制，因此對循環miRNA用于診斷的可行性有許多不確定性。首先大多數研究中的樣本量較小，收集的樣本處于疾病的不同階段，導致同一種循環miRNA在冠心病中的升高或降低程度不一致，甚至有些miRNA在不同報告中呈相反的趨勢。其次，檢測循環miRNA的方法雖已很成熟，但循環miRNA的含量較低而檢測不出的情況時有發生。此外，循環miRNA的提取、定量方法及使用的參照基因未統一，導致檢測結果無可比性。所以，穩定的循環miRNA作為冠心病的潛在生物標志物雖具有很高的應用價值，但目前還不能用于臨床，需擴大研究的樣本量并優化檢測方法，對循環miRNA的應用進行大規模的驗證。

表1 從冠心病近期研究中選取的循環miRNA總結

續表miRNA 變化研究群體檢測方法作用樣本類型參考文獻miR-155miR-223上調上調CHD(n=300)vscontrol(n=100)qRT-PCR嚴重程度評估血漿[30-31]miR-19a下調CAD(n=487)post-stroke(n=329)預后(風險評估)血漿[33]miR-423-3p上調CAD(n=69)vsHC(n=60)small RNA sequencingqRT-PCR預后(風險評估)血清PBMCECs[34]miR-21上調ACS(n=44)vscontrol(n=25)qRT-PCR預后(MACEs)血漿[35]miR-142上調CAD(n=1 345)NGSqRT-PCR預后(MACEs)血漿[36]miR-133amiR-208bmiR-126miR-197miR-223miR-122-5pmiR-499-5pmiR-134miR-328miR-34a上調上調上調上調上調上調上調上調上調上調CAD(n=3 112)qRT-PCR預后(死亡率、MACEs)血清血漿[37]miR-19alet-7fmiR-210miR-296下調下調下調下調RASP(n=113)vsnon-RASP(n=173)qRT-PCR預后(RASP)血漿[38]miR-19amiR-126miR-210miR-378下調下調下調不變retenosis(n=64)vsnon-retenosis(n=222)qRT-PCR預后(再狹窄)血漿[38]