生大黃粉治療新生大鼠壞死性小腸結腸炎模型腸損傷的實驗研究*

馮愛民，謝秀春，吳夏穎，于 瑛，王 苗，郭小霞，羅世杰，張 卉

陜西中醫藥大學附屬醫院兒科，陜西 咸陽 712000

胃腸功能障礙在新生兒重癥監護室發生比例高［1］，是新生兒疾病加重的表現之一，同時被認為是多器官功能障礙的始動因素［2］，其中缺氧、嚴重感染及早產是導致新生兒胃腸功能障礙的中心環節［3-4］。新生兒胃腸功能障礙無特異治療方法，臨床上采取綜合治療方案，給予禁食、胃腸減壓等措施，生大黃在成人胃腸功能障礙中［5-6］、大兒童疾病中應用相對成熟［7-8］，但用于新生兒疾病報道相對較少［9-10］。本課題將腸損傷新生大鼠作為研究對象，觀察生大黃粉灌胃后治療組臨床表現、腸道病理組織變化及炎性介質血小板激活因子（PAF）、白細胞介素-6（IL-6）值的變化，初步探討中藥生大黃粉與新生大鼠腸損傷之間的關系，為腸損傷進一步防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

新生2 日齡大鼠，雌雄不限，體重5～10 g，西安交通大學實驗動物中心提供。

1.2 藥品及試劑

生大黃粉（陜西中醫藥大學制劑室提供）；早產兒配方奶（雀巢特別能恩）：每100 g粉末含蛋白質14.4 g，脂肪25.9 g，碳水化合物53.2 g，熱量2108 KJ；蛋白粉（G20140134，廣東湯臣倍健生物科技公司）：每100 g 粉末含蛋白質80 g；脂肪乳（中/長鏈脂肪乳注射液C14-24，國藥準字H20030609，華瑞制藥有限公司）：含大豆油20 g，卵磷脂1.2 g，甘油2.2 g，能量840 KJ；脂多糖（LPS，西安灝洋生物技術有限公司）：10 mg/支；大鼠PAF ELISA 檢測試劑盒（RA20040，上海橋杜生物科技有限公司）；大鼠IL-6ELISA 檢測試劑盒（RA20064，上海橋杜生物科技有限公司）。

1.3 主要儀器

新生鼠保育箱（自制）：可控溫度、濕度；灌胃器（重慶渝科實驗耗材公司）：幼鼠專用6號5 cm彎針頭、7號5 cm直針頭和1 ml 注射器組成；缺氧箱（自制，密閉塑料泡沫箱）：有出入氣孔各一；醫用氮氣（配備儲氣罐及氮氣流量表，咸陽市秦虹氣體制造有限公司）：純度≥99.9%；醫用氧氣（陜西中醫藥大學附屬醫院制氧站）；便攜式數字測氧儀（CY-12C，建德市梅城電化分析儀器廠）等。

1.4 分組、造模及給藥

取新生大鼠60 只，按照隨機表法分為ABCDEF 共6組：A 組空白對照組、B組造模組、C組生理鹽水組、D 組生大黃大劑量組、E 組生大黃中劑量組、F 組生大黃小劑量組，其中D、E、F 三組稱為治療組，每組10 只，適應性喂養1天。

按照文獻造模［11-12］，每組均灌胃混合奶粉喂養，每次0.2 ml，間隔6 小時1 次，每天每次增加0.05 ml。往缺氧箱內注入100% 氮氣（N2），應用測氧儀測得箱內氧濃度為0，將除A 組外余50 只新生大鼠放入缺氧箱內90 秒，取出后再放入40%～80%復氧箱中給予2分鐘吸氧，之后將其放入4℃冰箱冷刺激，10 分鐘后取出，每天2 次，同時每組下午灌胃脂多糖(LPS) 0.1 ml(10 mg/g),每天1次，連續3天。B組作為模型組，不給予治療；冷刺激后治療組：D組、E組、F 組分別灌胃大黃粉液0.1 ml，C 組灌胃生理鹽水0.1 ml，均每日3 次，間隔8 小時1 次，連續3 天，出現溢乳、拒乳、腹脹或排黑色血便，提示造模成功。

根據小嬰兒生大黃用量［13-14］，按體表面積法［15］換算成大鼠用藥量。大劑量組灌胃生大黃粉2 675.4 mg/kg/d,0.1 ml 相當于28 mg；中劑量組1 337.7 mg/kg/d，0.1 ml 相當于14 mg；小劑量組668.8 mg/kg/d，相當于7 mg。代乳品參考Barna 等報道配制［16］，稱取早產兒配方奶5 g、蛋白粉10 g，脂肪乳50 ml，加入約80℃滅菌水至100 ml，每日配奶1 次，置于4℃冰箱冷藏保存，每次灌胃前置于60℃溫水中溫熱，熱卡約5 254 kJ/L，相當于母鼠奶熱卡。本實驗已通過醫院動物倫理委員會批準。

1.5 臨床觀察、病理切片及指標檢測

每日8 時稱量并記錄各組新生大鼠體質量，隨時觀察其一般狀況：精神反應、活動、對刺激反應、膚色、進食、腹脹、嘔吐及大小便性狀等。第5 天所有新生大鼠于最后1次喂養完成后空腹12小時，用頸椎脫臼法處死，并置于無菌操作臺上，立即清潔并用75%酒精消毒腹部皮膚，以清潔眼科剪自腹正中線打開腹腔，眼科鑷仔細分離腸系膜及血管后取出十二指腸下端至回盲部腸管，留取回盲部近端腸管上下各約1 cm腸組織，平鋪并用紗布包裹后放入十二指腸下端至回盲部余腸組織，放入冷生理鹽水中漂洗、濾紙拭干稱重、在冰水環境下加入9 倍生理鹽水，研磨腸組織勻漿、離心，取上清液，放置于-80℃冰箱中，采用ELISA 雙抗夾心法檢測腸組織PAF、IL-6 含量，嚴格按酶聯免疫試劑盒說明操作。

1.6 腸組織病理評分

采用Khailova 等［17-18］的標準進行腸組織損傷評分。腸道絨毛和上皮完整，組織結構正常，記0 分；輕微黏膜下和(或) 固有層腫脹分離，記1 分； 中度黏膜下和(或)固有層分離，黏膜下和(或)肌層水腫，記2 分；重度黏膜下和(或)固有層分離，黏膜下和(或)肌層水腫，局部絨毛脫落，記3 分；腸道絨毛消失伴腸壞死，記4 分。每張切片觀察3 個視野，取平均值，評分≥2 分診斷壞死性小腸結腸炎（NEC）。

1.7 統計學方法

全部實驗數據均輸入計算機，采用SPSS 20.0 醫學統計軟件進行統計處理與分析。所有計量資料數據采用均數±標準差（±s）表示，對多組間數據比較采用單因素方差分析，組間比較采用Kruskal-WallisH 檢驗。結果的顯著性以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 一般情況

除A 組空白對照組外，余各組放入缺氧箱后新生鼠相繼出現煩躁、呼吸困難、發紺、全身青紫、大小便失禁、反應遲鈍，甚至呼吸暫停。復氧后新生鼠逐漸恢復自主活動，膚色轉紅，但各組需時間不一樣，治療組需時間短，復氧需幾十秒或1 min 左右，造模組、生理鹽水組需時間長，約3 min；之后將其置于4℃冰箱冷刺激，計時10 min后取出，新生鼠出現全身皮膚冰冷，膚色發白，立即置于保育箱保暖，治療組膚色不足1 min恢復，B組、C組約2～3 min 膚色恢復。A 組活動自如，無腹瀉、溢奶、膚色紅潤。造模組B 組、鹽水對照組C 組第2～3 天不同程度表現精神差、活動少、溢乳、排褐色大便、膚色偏暗稍干燥。中藥大中小劑量組各組活動、反應可，奶量能完成，膚色紅稍干燥，小劑量組有2 例排褐色大便，大劑量組有4 例排黃色稀水便。

2.2 體重情況

實驗前各組體重比較差異無統計學意義（P＞0.05）；造模后B、C、D、E、F各組與空白對照A組比較，體重均減少，差異有統計學意義（P＜0.05）；其中B 組與C 組體重下降差異無統計學意義（P＜0.05），D、E、F 各治療組與B組、C 組比較，體重均有增加，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

2.3 生大黃粉對腸損傷組織中PAF和IL-6含量的影響

B、C組與A 組比較，PAF、IL-6含量增加，差異有統計學意義（P＜0.05）；D、E、F 各治療組與B、C 組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；D、E、F 各治療組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表2

表1 新生鼠實驗前后體重增加情況（±s）

表1 新生鼠實驗前后體重增加情況（±s）

注：與A組比較，aP＜0.05；與B組比較，bP＜0.05；與C組比較，cP＜0.05

組別A組（空白對照組，n=10）B組（模型對照組，n=10）C組（生理鹽水組，n=10）D組（生大黃大劑量組，n=10）E組（生大黃中劑量組，n=10）F組（生大黃小劑量組，n=10）FHP實驗前體重（g）10.55±0.70 10.74±0.79 10.71±0.74 10.95±0.73 10.88±0.71 11.00±0.78 0.528-0.754實驗后體重（g）13.8±1.05 9.95±0.87a 9.99±0.75a 11.16±0.84abc 11.12±0.73abc 11.22±0.77abc 27.720-0.000體重增加值(g)3.25±0.58-0.79±0.40a-0.72±0.23a 0.21±0.35abc 0.23±0.12abc 0.22±0.14abc-48.047 0.000

表2 生大黃粉對腸損傷組織中PAF和IL-6含量的影響

2.4 腸組織損傷病理評分結果

造模組、生理鹽水組均有腸損傷表現，大中小劑量組腸損傷程度與造模組、生理鹽水組比較差異有統計學意義（P＜0.05），且大多居于1～2分，與空白組比較，仍有腸道損傷發生，見表3、圖1。

表3 腸組織損傷病理評分

3 討論

圖1 腸損傷病理切片

本實驗選用新生大鼠作為實驗對象，模擬人類新生兒胃腸功能常見誘因［3］，給予缺氧、復氧、冷刺激及脂多糖灌胃制作腸損傷模型，大體解剖腸腔擴張，病理切片提示：粘膜下層、固有層腫脹分離，粘膜下層、肌肉層水腫，局部腸絨毛脫落、消失或壞死，表明新生鼠腸損傷造模成功。實驗后造模組、生理鹽水組較空白對照組體重下降，生大黃大中小劑量組較造模組、生理鹽水組體重增加，差異均有統計學意義。病理切片提示造模組、生理鹽水組腸粘膜損傷幾乎100%，與空白對照組比較差異有統計學意義，后者無腸道損傷表現，排除因灌胃導致腸道損傷；與生大黃大中小劑量組比較差異有統計學意義，提示生大黃粉能減輕或防治新生大鼠受到缺氧等刺激時胃腸道損傷。病理切片結果與臨床表現基本一致，缺氧、冷刺激后各組均表現膚色發紺、精神反應差，但復氧時治療組相對空白對照組、造模組各組不良癥狀消失快，膚色恢復快。本實驗生大黃大中小劑量組腸道損傷病理切片表現無明顯差異，可能表示生大黃療效與在一定范圍能與劑量關系不大，需進一步明確。

從胃腸功能障礙產生機制看，缺氧、感染可直接導致腸黏膜損傷，同時產生許多細胞因子及炎癥介質參與，其中血小板因子（PAF）是大多數的細胞及組織產生的一種磷脂炎癥介導因子，該因子可以導致人體上皮細胞受到損傷甚至凋亡，促使白細胞和血小板聚集，引起血管收縮并使得血管的通透性增加［19-20］。 實驗表明［21］, 注射大劑量PAF, 大鼠可迅速發生腸壞死，壞死一般呈局灶性, 可累及空腸、回腸(尤其是遠端回腸)和/或盲腸。IL-6 是許多細胞因子中其一，是由免疫細胞產生的，對腸道的損傷作用主要通過活化淋巴細胞、誘導B 細胞分泌和誘導具有細胞毒性的T細胞分化、催化并放大炎癥反應和毒性作用，并有調節其他細胞因子的能力，造成腸道等組織細胞損傷［22-23］。

周于新等［24］實驗報道生大黃具有與腸三葉因子相同的防治NEC的效果，能減少缺氧腸損傷組織中腫瘤壞死性因子（TNF-a）及丙二醛(MDA)的產生,具有相同的保護缺氧性腸黏膜損傷的作用。本實驗發現造模組、生理鹽水組腸組織PAF、IL-6 與空白組比較明顯升高，有統計學差異，喂藥大中小劑量組較造模組、生理鹽水組顯著下降，提示灌胃生大黃可能通過降低應激腸道組織PAF、IL-6 水平，從而減輕全身炎癥反應，對腸道組織及全身起保護作用，與文獻報道一致［9］。

初生兒先天稟賦不足，尤其表現為脾常不足，失于運化，中焦氣機阻滯，加之腹中穢物未下凈，失于通降，而致胃腸積滯。新生兒胃腸功能障礙其病因雖為脾胃虛弱，但依據“急則治其標”的原則，當以腑氣不通為主要矛盾，胃及大小腸皆屬于“腑”，“腑以通為順”，治療上應以消積導滯，逐穢通腑為法。生大黃是傳統的中草藥，具有清熱解毒、宣通氣機、通里攻下、活血化瘀的作用［25］，其下積滯、行瘀結的功效正好與新生兒胃腸功能障礙腑氣不通、氣滯血瘀的病機相契合；新生兒大鼠中醫證型多樣化，本研究主要從大鼠腑氣不通、氣滯血瘀型討論，與其他證型的關系有待進一步研究。

本研究表明生大黃粉灌胃能降低新生大鼠腸損傷模型中腸組織PAF、IL-6 水平，同時能減輕或避免腸組織病理改變。由此推測，生大黃對胃腸功能障礙腸黏膜損傷保護作用的機制可能通過調控炎性因子來減輕腸道的炎癥反應，提示生大黃粉可能是防治新生兒胃腸功能障礙的藥物，鑒于生大黃成分多，靶點多，其作用機制與其有關成分的關系及其他相關因子的關系有待進一步研究。生大黃大中小劑量組對腸損傷病理切片改善無明顯差異，提示生大黃治療劑量范圍相對較廣，需進一步研究。

綜上所述，生大黃粉灌胃對新生兒大鼠腸粘膜損傷有保護作用，與空白組比較，仍有腸道損傷發生，故生大黃粉不能完全預防缺氧、寒冷、感染等刺激導致的腸道粘膜損傷，需進一步研究探討。