結核性與惡性胸腔積液中微小核糖核酸內參基因篩選的初步研究

董靜 賈紅彥 孫琦 李自慧 魏榮榮 杜博平 邢愛英 潘麗萍 張宗德

結核性胸膜炎是病理性胸腔積液形成的主要原因之一[1]。由于其臨床表現不典型，需病原學檢測來確診。但目前胸腔積液的多種病原學檢測方法的臨床應用均不理想，如分枝桿菌抗酸染色和BACTEC MGIT 960快速液體培養的陽性率均較低，僅為10%和20%左右；γ干擾素釋放試驗難以區分結核分枝桿菌潛伏感染，特異度較低[2]；穿刺活檢和胸腔鏡活檢病理學檢查雖可使陽性率提升至56%以上，但患者難以耐受侵入式檢查，并發癥較多，對醫生操作水平和設備的要求也較高[3]；而新一代實時熒光定量核酸擴增檢測(GeneXpert MTB/RIF Ultra)技術也對30%～50%的疑似患者無法確診[4-6]。臨床亟需有效的新型檢測方法。

微小核糖核酸(miRNA)是一類長度為19～25個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子[7-8]，主要通過3′UTR區完全或不完全互補配對，結合相應靶mRNA 來抑制相應蛋白質的翻譯[9]。相對于蛋白和長鏈RNA，miRNA具有抗酸、抗堿、抗核糖核酸酶，反復凍融不易降解的穩定性質[10]，且已被大量研究證實，miRNA的動態變化與疾病的發生發展和轉歸有著十分密切的關系[1, 11-12]。但胸腔積液中miRNA含量較少、豐度偏低、缺乏公認的可相對定量檢測的內參基因，阻礙了對胸腔積液中miRNA的相關研究[1]。為評估胸腔積液中miRNA內參基因定量檢測的可行性，本研究選取了7個應用頻次較高的定量檢測胸腔積液及其他體液中miRNA表達量的內參基因，通過geNorm、NormFinder和BestKeeper軟件分析并了解其在胸腔積液標本中定量檢測的穩定性和表達豐度，為后期研究胸腔積液miRNA的動態變化與疾病的發生發展和轉歸關系提供基礎支撐。

對象和方法

一、研究對象

搜集2016年9月至2018年12月在首都醫科大學附屬北京胸科醫院經胸腔積液常規生化和涂片鏡檢、核酸檢測、細菌和真菌培養、分枝桿菌改良羅氏培養，以及細胞學、病理學、胸部CT掃描等檢查結果確診治療的47例結核性胸膜炎患者和31例并發胸腔積液的癌癥患者作為研究對象。所有入選患者均排除HIV感染、乙型和丙型病毒性肝炎、梅毒螺旋體感染、妊娠，以及有免疫抑制劑用藥史、結核病病史和結核病密切接觸史者。

78例患者中，男51例(65.4%)，女27例(34.6%)；年齡25～88歲，年齡中位數(四分位數)為60(30，68)歲。其中，結核性胸膜炎患者中，男35例(74.5%)，女12例(25.5%)；年齡18～86歲，年齡中位數(四分位數)為46(25，64)歲；胸腔積液分枝桿菌培養陽性15例(31.9%)、涂片抗酸桿菌染色陽性5例(10.6%)、PCR擴增結核分枝桿菌基因保守序列檢測陽性12例(25.5%)、GeneXpert MTB/RIF檢測陽性14例(29.8%)，GeneXpert MTB/RIF和PCR擴增結核分枝桿菌基因保守序列同時陽性1例(2.1%)。并發胸腔積液的癌癥患者中，男16例(51.6%)，女15例(48.4%)；年齡38～88歲，年齡中位數(四分位數)為65(59，69)歲；經組織病理檢測和既往病史確診腺癌(包括腺癌轉移)21例(67.7%)，其他類型癌癥(包括鱗癌、小細胞肺癌、間皮瘤肺轉移、霍奇金淋巴瘤肺部轉移等)10例(32.3%)。本研究通過首都醫科大學附屬北京胸科醫院倫理委員會批準[(2020)年臨審第(2號)]。

二、研究方法

1.miRNA內參基因的選擇：選擇胸腔積液及其他體液中用于miRNA表達量定量檢測應用頻次較高的5個內參基因(包括miR-16、miR-20a、miR-192、U6、Cel-miR-39)[7, 13-14]，以及前期研究中高通量篩選獲得的2個穩定表達的miRNA(包括miR-1268和miR-4281)。

2.標本收集與處理：留存每例研究對象常規檢測后的胸腔積液標本2 ml，4 ℃下2000×g離心10 min，再經16 000×g離心10 min，吸取上清，根據實際情況分裝，每管200 μl，-80 ℃凍存備用。另采集2例患者胸腔積液標本各1 ml，各等分為5管，其中1管采集后直接如上離心處理，另3管采集后分別放置1 h、2 h、4 h后如上離心處理，最后1管反復凍融2次后如上離心處理。5管處理后均于-80 ℃凍存備用，用以分析放置不同時間及2次凍融后胸腔積液內miRNA內參基因表達量的變化比較。

3.RNA提取：采用miRNeasy Serum/Plasma kit血液/血漿RNA提取純化試劑盒(德國Qiagen公司，批號：217184)提取胸腔積液標本中的RNA。操作步驟如下：取200 μl胸腔積液標本，加入1 ml RNA提取試劑，室溫放置5 min，再加入3.5 μl Spike-In control工作液(德國Qiagen公司，批號：219610，5.6×108拷貝，2.67×10-1pmol/ml)和200 μl三氯甲烷，振蕩15 s，放置2 min，4 ℃環境下12 000×g離心15 min，棄上清，加入1.5倍體積的無水乙醇，置于試劑盒配套的收集柱內，10 000×g離心15 s，先后經洗液Ⅰ、洗液Ⅱ和80%乙醇洗滌，收集RNA。再以微量紫外分光光度計(Nanodrop 2000)測定RNA含量。為分析同1例患者的2份胸腔積液標本中miRNA定量檢測的一致性，從上述標本中任意挑選5例患者的2管200 μl胸腔積液標本，進行如上操作，以測定重復標本miRNA檢測的一致性。

4.加尾法逆轉錄：按照miScript Ⅱ RT Kit反轉錄試劑盒(德國Qiagen公司，批號：218161)配套說明書進行如下逆轉錄操作：取4 μl高特異性反轉錄緩沖濃縮液(5×miScript HiSpec緩沖液)、2 μl核酸混合物濃縮液(miScript nucleics mix)、2 μl反轉錄酶(miScript reverse transcriptase mix)、100 ng RNA和適量無酶水(RNase-free ddH2O)組成20 μl反轉錄體系。37 ℃孵育60 min，95 ℃滅活5 min，完成反轉錄，產物于-80 ℃保存。

5.PCR預擴增檢測：按照miScript PreAMP PCR Kit預擴增PCR試劑盒(德國qiagen公司，批號：331452)說明書進行預擴增，其中，7個待檢miRNA引物均購自德國Qiagen公司。操作步驟如下：取待檢測miRNA的引物濃縮液各10 μl，混合并稀釋至工作液，制成引物混合物備用。按說明書配置成25 μl預擴增反應體系，在Mycycler普通PCR儀上(美國Bio-Rad公司)設置反應程序如下：95 ℃ 15 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 3 min，循環12次。

6.實時熒光定量PCR檢測和熔解曲線分析：使用miScript SYBR Green PCR Kit實時熒光定量PCR試劑盒(德國Qiagen公司，批號：218073)，按照說明書配置20 μl擴增體系。程序設置為：95 ℃ 15 min，94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，循環40次，在Thermofisher Quantistudio 7實時熒光定量PCR儀(美國賽默飛世爾公司)上完成。根據擴增曲線得到引物擴增效率和miRNA的內參基因表達量[循環閾值(Ct值)]。Ct值越低，表示基因表達量越高，基因表達的豐度越好，越適合作為內參基因用于相對定量；引物擴增效率為90%～110%之間，表示可以用于后續胸腔積液中miRNA的檢測；當熔解曲線平滑，僅有單一主峰時，表明擴增產物特異度較好。

7.軟件評估及判讀：使用geNorm(https://genorm.cmgg.be/)、NormFinder(https://moma.dk/Normfinder-software)和BestKeeper(http://www.gene-quantification.de/bestkeeper.html)3種軟件分析內參基因的表達穩定性。其中，通過geNorm軟件可計算出代表每個內參基因穩定性的M值來篩選出穩定性較好的內參基因，M值越小表示內參基因的穩定性越好，該軟件設定的閾值為1.5；通過NormFinder軟件計算出的穩定值越小，表示內參基因穩定性越好；而BestKeeper軟件主要通過表格內置公式，計算出待測基因的Ct值的“均數±標準差”和變異系數，標準差和變異系數越小，表示內參基因越穩定，越適合作為內參基因。

三、統計學處理

結 果

一、miRNA表達豐度的分析

78份標本中，7種內參基因miR-1268、Cel-miR-39、miR-16、miR-192、miR-20a、miR-4281、U6檢測的Ct值從低至高分別為19.16±4.40、24.17±0.73、24.52±1.65、27.54±1.36、28.47±1.72、28.58±2.09、30.31±1.56；擴增效率分別為90%、101%、110%、93%、97%、97%、90%，均可以用于后續胸腔積液miRNA檢測；且7種內參基因的熔解曲線均為平滑且僅有單一主峰，顯示特異度均較好。

二、miRNA表達穩定性的分析

通過3種軟件的分析，Cel-miR-39更適合作為內參基因，具體如下：

1. geNorm軟件分析：Cel-miR-39、miR-192、U6、miR-20a、miR-16等5種內參基因的M值分別為0.994、1.003、1.224、1.376、1.484，均符合軟件設定的閾值(<1.5)，穩定性較好。而miR-4281和miR-1268的M值分別為1.612和2.078，均不符合軟件設定的閾值，穩定性較差。

2.NormFinder軟件分析：Cel-miR-39的穩定值為0.674，優于其他6種內參基因，即U6、miR-192、miR-20a、miR-16、miR-4281、miR-1268分別為0.813、0.890、0.936、1.057、1.140、3.041。

3.BestKeeper軟件分析：Cel-miR-39在78份標本中的Ct值為24.17±0.73，低于除miR-1268外其他內參基因的Ct值，且標準差和變異系數均較低；而miR-1268雖然Ct值較低，但是標準差和變異系數高，并不適合作為相對定量檢測的內參基因，具體見表1。

三、miRNA檢測重復性分析

對5例患者胸腔積液標本(各2份)miRNA含量進行可重復性檢測顯示： 7個內參基因兩次檢測Ct值的比較，結果均未見差異(表2)，說明本實驗對胸腔積液標本中RNA提取和miRNA定量檢測均具有較好的穩定性。

四、不同標本處理方法對胸腔積液miRNA定量檢測的影響

對不同處理時間和2次凍融胸腔積液標本進行實驗，結果顯示：在標本采集后1 h、2 h、4 h及反復凍融2次后，7種內參miRNA的表達量與采樣后立即處理時的表達量比較，差異均無統計學意義(表3)。

表2 胸腔積液標本中miRNA檢測重復性分析

表3 七種內參基因在不同處理方式胸腔積液標本中的表達情況

討 論

當前，結核性胸膜炎的臨床診斷和鑒別診斷仍存在困難，通過選擇合適的生物標志物進行組織液活檢用于輔助診斷越來越受到關注[15]。胸腔積液是臨床上常見的一種病理狀態，主要分為漏出液和滲出液。前者常通過成分和詳細詢問病史來進行臨床判斷，而后者的病因種類繁多，最常見于結核性胸腔積液和癌性胸腔積液[16-17]，分別占比為40%和30%左右[18-19]。由于筆者所在醫院的特殊性，可選擇用于研究的患者標本均為結核性和惡性胸腔積液，故本研究對所選取的研究對象進行胸腔積液miRNA內參基因相對定量的檢測的結果具有一定的代表性。

現階段關于miRNA定量檢測的實驗技術主要有基因芯片、二代測序和實時熒光定量PCR。前兩種方法屬高通量檢測，常用于初步篩查；而熒光定量PCR技術由于較敏感，易出現誤差，常通過目的基因與內參基因的差值來進行相對定量檢測，已成為現階段主要的實驗方法。因此，選擇合適的內參基因對于實驗結果的客觀呈現有著重要意義[20]。既往研究提示，在某種類型標本中公認的穩定的內參基因，并不一定在其他類型標本中也穩定[7]。針對不同標本類型，通常應有相對的特異性標準內參基因，如血漿或細胞中miRNA的相關研究通常使用U6[13]。但在對胸腔積液miRNA的定量檢測研究中，并沒有業界認可的統一的標準內參基因。在生物標識物研究中，大多數的研究者為了保證內參基因表達的均一穩定，會在開始進行正式的實時熒光定量PCR檢測前，根據實驗標本類型和研究疾病嘗試多種比較常見的內參基因，或通過前期實驗發現相對穩定的內參基因，以選擇出有針對性的內參基因。

通過前期檢索國內外文獻，筆者發現內源性基因U6、RNU44、RNU48、miR-192、miR-20a均被較多地應用于胸腔積液miRNA內參基因的定量檢測中[14]。并在2014年前后被較多研究證實，相對于RNU44、RNU48，U6更合適作為內參基因進行相對定量檢測，并在其后的一段時間內被廣泛應用于很多相關實驗中[13]。但本次研究發現，雖然U6的應用時間較長，但其Ct值較大，豐度較低，且在個別標本中存在未能成功擴增的現象，故筆者認為U6不是結核性和惡性胸腔積液miRNA相對定量檢測中最合適的內參基因。此外，雖然Han等[7]建議選擇miR-192作為內參基因來對胸腔積液miRNA進行定量檢測，但在對胸腔積液細胞的進一步研究中發現，其可作為鑒別良惡性胸腔積液的敏感性生物標識[21]，且在2018年被Filipska等[22]發現其在鱗狀細胞肺癌細胞化學治療的耐藥性和侵襲性方面有生物學作用，故筆者認為miR-192并不能作為胸腔積液miRNA檢測最合適的內參基因。miR-20a也曾被證實參與了抑癌網絡調控[23]，而miR-16僅作為內參基因應用于血液miRNA的定量檢測[24]。結合本次實驗結果，發現以上miRNA內參基因在胸腔積液中的表達穩定性較差，可能并不適合作為結核性和惡性胸腔積液miRNA定量檢測的內參基因，提示在一些研究中相對穩定的U6或miR-16并不能推廣于結核性和惡性胸腔積液標本檢測，可能與不同標本和疾病類型之間的表達譜存在差異有關。

miR-4281和miR-1268是筆者團隊在前期進行胸腔積液miRNA高通量篩選中獲得的標本間相對穩定表達的miRNA內參基因。但由于前期高通量篩選的標本數量有限，導致在擴大研究后發現這兩個miRNA內參基因的表達穩定性并不好，并不適合作為內參基因。這也提示在選擇內參基因時，應慎重選擇那些通過高通量篩選技術獲得的相對穩定的miRNA，不能僅基于高通量檢測結果而盲目選擇。

相對于細胞和組織，除血液外，在胸腔積液、腦脊液等體液中能夠穩定表達的miRNA內參基因并沒有被發現，這也是研究人員嘗試引入外源性miRNA基因來進行定量檢測的主要原因[25]。Cel-miR-39就是其中1個被引入最多的內參基因[25-26]。Cel-miR-39是人工合成的線蟲序列miRNA，是在RNA提取過程中人為添加的外源性對照，其含量與體內病理變化沒有直接聯系，通常作為檢測標準化的外源性對照[27]，但在胸腔積液中并沒有太多的研究。僅發現Wang等[28]在2017年對胸腔積液外泌體miRNA的研究中使用其作為實時熒光定量PCR檢測的參照基因。結合本研究結果可以初步認為，在未發現胸腔積液中存在更加穩定表達的其他內參基因時，可以選擇Cel-miR-39作為內參基因進行miRNA的定量檢測。

目前，國內外并沒有對于內參基因綜合評價的統一標準，而geNorm、NormFinder和BestKeeper軟件是內參基因篩選常用的軟件，在其他類型標本中已被廣泛應用[29-30]。本研究使用這3個軟件分析內參基因的穩定性時，發現Cel-miR-39在3個軟件中均表現出最佳的穩定性，且7個內參基因的穩定性排序并不完全相同，與既往的研究中發現“NormFinder軟件顯示U6的穩定性優于miR-192，但BestKeeper軟件顯示miR-192的穩定性優于U6”的結果相似[7]，可能與不同軟件內置的計算模式不相同有關。但本研究僅通過這3個軟件來評估7個miRNA內參基因的檢測穩定性和表達豐度，可能存在評估不全面的問題；而且，在以內參基因為標準對靶標基因進行相對定量檢測時，還要考慮擴增效率的因素。當靶標基因和內參基因擴增效率基本一致時，才能保證檢測的客觀性和準確性[7]。此外，有學者提出可同時采用內源性和外源性內參基因進行相對定量檢測[26]，但如何將內源性和外源性基因進行聯合，抑或是分別基于內源性和外源性內參基因進行相對定量檢測，目前并沒有明確的標準或依據。因此，本研究也未聯合多個內參基因用于定量檢測評價。但希望在未來研究中，能開發出基于數學模型的miRNA多內參基因的聯合定量檢測。

綜上所述，本研究針對胸腔積液中miRNA的定量檢測進行了內參基因的篩選，通過3個計算軟件比較了7個候選內參基因的表達穩定性，并分析了標本不同處理方式對miRNA檢測的影響，發現Cel-miR-39穩定性最好，表達豐度適中，適宜作為實時熒光定量PCR技術定量檢測胸腔積液miRNA表達量的內參基因。