11種結核分枝桿菌抗原皮膚試驗反應效果評價

段惠娟 褚洪遷 孔成成 戴廣明 曹廷明 孫照剛

結核菌素純蛋白衍生物(PPD)試驗廣泛用于結核病流行病學調查、卡介苗(BCG)接種檢測、結核病篩查，以及結核病臨床診斷等方面。但由于PPD是多種抗原的混合物，其結果受到BCG接種及其他分枝桿菌感染的影響，診斷特異度低[1]。因此，在BCG普遍接種的地區，PPD試驗用于結核分枝桿菌(MTB)感染檢測受到了較大限制。近年來，利用結核分枝桿菌復合群(MTBC)中不同細菌[如MTB、牛分枝桿菌或BCG基因組中存在的缺失片段(RD區)]的特異性，為開發新的高特異性診斷試劑提供了研究方向[2]。目前，重組結核桿菌融合蛋白(EC)[結核分枝桿菌早期分泌性抗原靶6(ESAT-6)和培養濾液蛋白10(CFP-10)重組融合蛋白]已作為新型MTB感染皮膚試驗的檢測試劑通過了國家藥品監督管理局藥品審批而準予上市[3]，能有效區分MTB感染和BCG接種。除此之外，對MPT64、Rv1985c、Rv0222、Rv3117及Rv3120等相關蛋白的研究表明，它們在結核病血清學診斷方面具有一定的潛力[4-7]，但用于MTB感染皮膚試驗鮮有報道。本研究篩選并表達了來自RD1、RD2、RD4、RD5、RD7、RD9、RD11區及MTB休眠相關抗原的12種重組抗原，以了解這些抗原用于MTB感染皮膚試驗的診斷效果。

材料和方法

一、實驗菌株

MTB標準株(H37Rv，ATCC27294)由首都醫科大學附屬北京胸科醫院北京結核病臨床數據和樣本資源庫提供，接種在中性改良羅氏培養基上放入37 ℃培養箱中培養3～4周。

二、實驗動物

無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級豚鼠，雌性，體質量250～300 g，共18只，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗動物生產許可證號：SCXK(京)2016-0011。

三、皮膚試驗抗原

1.標準品：50 IU TB-PPD(產品批號：20190510)購自北京祥瑞生物制品有限公司。

2.MTB特異性抗原：(1)篩選蛋白標準：①RD區抗原：在BCG中缺失，均能引起T細胞反應；②MTB 休眠相關抗原：與結核分枝桿菌潛伏感染(LTBI)有關。(2)抗原：共表達12種抗原(表1)；(3)蛋白的表達純化：①根據GenBank數據庫中MTB中各抗原的基因序列設計合成引物；②PCR擴增；③構建重組質粒及轉化至大腸桿菌；④進行蛋白的誘導表達及純化，其中，包涵體形式的蛋白在表達后，將超聲破碎后的菌液離心去上清，沉淀用適當體積的8 mol/L尿素充分溶解，再離心取上清，再將其稀釋為 20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，4 mol/L尿素，pH 8.0 體系。再次離心，取上清，進行純化，純化后電泳。

四、MTB特異性抗原皮膚試驗濃度

1.EC抗原：稀釋終濃度至5 μg/ml。

2.其他抗原：將各抗原濃度分別用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋至終濃度為50 μg/ml、5 μg/ml、1 μg/ml。本研究抗原濃度均根據EC濃度注射，EC皮膚試驗注射量為每0.1 ml劑量0.5 μg[8-9]和0.1 μg[1]。考慮到本實驗均為單個抗原，因此，在此基礎上將抗原最高濃度提高至每0.1 ml劑量5 μg。

表1 用于豚鼠皮膚試驗所篩選的結核分枝桿菌抗原

五、豚鼠致敏及皮膚試驗

1.分組：共18只豚鼠，分為高(5 μg)、中(0.5 μg)、低(0.1 μg)劑量3組，每組6只，每只豚鼠注射6種蛋白，重復3次。

2.致敏豚鼠：(1)準備菌液：磨菌，測量菌液在波長600 nm處的吸光度(A600)值，使A600=1[菌液濃度為3.8×108菌落形成單位(CFU)/ml]，稀釋10倍，使菌液終濃度為3.8×107CFU/ml。(2)致敏：每只豚鼠大腿腹股溝皮下注射0.5 ml H37Rv菌液，感染4周。

3.皮膚試驗：豚鼠背部去毛，用1 ml注射器皮內注射。TB-PPD和各抗原均注射0.1 ml，注射24 h 和48 h后測量硬結橫徑和縱徑，計算硬結平均直徑[(橫徑+縱徑)/2]。

4.判斷標準：以硬結平均直徑<5 mm為陰性，≥5 mm為陽性，凡有水皰和壞死者均屬于強陽性反應[3, 8]。

六、統計學處理

用Microsoft Excel 2010進行統計，用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。計量資料為偏態分布，以“中位數(四分位數)[M(Q1，Q3)]”表示，采用配對樣本比較的Wilcoxon符號秩檢驗分析各抗原注射24 h和48 h后硬結平均直徑的差異；采用Kruskal-WallisH檢驗比較多組抗原之間硬結平均直徑的差異，雙側檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、抗原表達純化結果

共表達12種MTB抗原，其中8種為包涵體形式，采用BCA(bicinchoninic acid)蛋白定量法檢測蛋白濃度，結果見表2。

表2 12種結核分枝桿菌抗原的表達純化情況

二、各抗原皮膚試驗反應情況

抗原劑量為5 μg時，多數抗原皮膚試驗反應24 h 時的硬結平均直徑均大于反應48 h，差異均有統計學意義；而MPT64、Rv1985c、Rv0222和Rv1738等皮膚試驗反應24 h和48 h的硬結平均直徑差異均無統計學意義(表3)。抗原劑量為0.5 μg時，Rv1985c和Rv1738皮膚試驗無任何反應；Rv3872、Rv0222、Rv3619c、Rv3425和Rv2626c等皮膚試驗反應24 h和48 h的硬結平均直徑差異均無統計學意義，其他抗原皮膚試驗反應24 h的硬結平均直徑均大于反應48 h(表4)。抗原劑量為0.1 μg 時，11種抗原皮試均無任何反應。皮膚試驗反應24 h時，TB-PPD(5 IU)和EC(0.5 μg劑量)的反應均為陽性(9/9，9/9)；在5 μg劑量時，Rv3120和Rv3619c的皮膚試驗效果相對較好，反應陽性率分別為9/9、8/9；在0.5 μg劑量時，MPT64和Rv3120的皮膚試驗效果相對較好，反應陽性率分別為7/7、6/7。MPT64(0.5 μg劑量)、Rv3120(5 μg劑量)和Rv3619c(5 μg劑量)皮膚試驗反應24 h硬結平均直徑中位數均>5 mm。

三、幾種優勢抗原皮膚試驗結果分析

皮膚試驗反應24 h時，TB-PPD(5 IU)、EC(0.5 μg 劑量)、MPT64(0.5 μg劑量)、Rv3120(5 μg劑量)和Rv3619c(5 μg劑量)硬結平均直徑差異有統計學意義(χ2=25.064，P=0.000)；EC(0.5 μg劑量)硬結平均直徑明顯大于TB-PPD(5 IU)，有統計學差異(H=-2.976，P=0.029)。MPT64(0.5 μg劑量)、Rv3120(5 μg劑量)和Rv3619c(5 μg劑量)與TB-PPD(5 IU)硬結平均直徑接近，差異均無統計學意義(H值分別為-0.496、0.819和1.714，P值分別為1.000、1.000和0.865)；MPT64(0.5 μg劑量)與EC(0.5 μg劑量)硬結平均直徑接近，差異無統計學意義(H=2.288，P=0.221)。Rv3120(5 μg劑量)和Rv3619c(5 μg劑量)硬結平均直徑均小于EC(0.5 μg劑量)，差異有統計學意義(H值分別為3.795和4.690，P值分別為0.001和0.000)。

表3 抗原劑量為5 μg時豚鼠皮膚試驗反應不同時間硬結平均直徑[mm，M(Q1，Q3)]

表4 抗原劑量為0.5 μg時豚鼠皮膚試驗反應不同時間硬結平均直徑[mm，M(Q1，Q3)]

皮膚試驗反應48 h時，TB-PPD(5 IU)、EC(0.5 μg 劑量)、MPT64(0.5 μg劑量)、Rv3120(5 μg劑量)和Rv3619c(5 μg劑量)硬結平均直徑差異有統計學意義(χ2=24.801，P=0.000)。TB-PPD(5 IU)和EC(0.5 μg劑量)硬結平均直徑差異無統計學意義(H=-1.573，P=1.000)；MPT64(0.5 μg 劑量)、Rv3120(5 μg劑量)和Rv3619c(5 μg劑量)與TB-PPD(5 IU)硬結平均直徑接近，差異均無統計學意義(H值分別為-0.262、2.241和2.608，P值分別為1.000、0.250和0.091)； MPT64(0.5 μg劑量)與EC(0.5 μg劑量)硬結平均直徑接近，差異無統計學意義(H=1.209，P=1.000)；Rv3120(5 μg 劑量)和Rv3619c(5 μg劑量)硬結平均直徑均小于EC(0.5 μg劑量)，差異均有統計學意義(H分別為3.814和4.181，P分別為0.001和0.000)。

討 論

目前，對MTB感染皮膚試驗抗原成分的研究是提高結核病診斷的重要方法。通過對RD區的研究，發現利用BCG的缺失區以及采用不同的缺失區蛋白抗原聯合進行皮膚試驗，可以在一定程度上提高其對結核病診斷的特異性和敏感性[10]。RD1區的EC抗原是近年來研究較多的抗原，其具有較高特異性，但敏感性尚不盡如人意[11]。而且，Hur等[12]提出由于MTB抗原表位的復雜性及患者免疫功能的個體差異，基于此融合抗原的檢測仍然存在局限性，僅依靠EC抗原多肽不足以覆蓋MTB引起宿主免疫反應的所有表位。因此，本研究表達了除EC抗原以外的11種抗原，對RD區及MTB休眠相關抗原的皮膚試驗效果進行研究，以了解其他抗原引起的遲發型超敏反應(delayed-type hypersensitivity，DTH)，提高其診斷結核病的特異性和敏感性。

豚鼠皮膚試驗反應出現的時間較早，一般在注射24 h后反應就出現且比較恒定[8]。本研究結果顯示，劑量為5 μg或0.5 μg時，多數抗原的皮膚試驗反應24 h時硬結平均直徑均明顯大于反應48 h，包括皮試效果相對較好的抗原Rv3120(5 μg劑量)、Rv3619c(5 μg劑量)和MPT64(0.5 μg劑量)在24 h 和48 h硬結平均直徑均有顯著差異，與都偉欣等[8]的報道不一致。究其原因，可能是MTB致敏濃度及豚鼠的個體差異所致。MTB通常在感染機體4周時達到穩定生長期，但其穩定期的細菌數與最初感染的細菌數量有關，而且MTB的濃度高低對機體免疫能力的影響有一定的差異[13-14]。

皮膚試驗反應硬結的大小，與皮試抗原劑量的多少有一定的關系[15]。本研究結果顯示，多數抗原5 μg劑量，比0.5 μg劑量的皮試反應效果好，而MPT64則在劑量為0.5 μg時皮試反應效果相對較好。其中，皮試反應效果相對較好的Rv3120(5 μg劑量)、Rv3619c(5 μg劑量)和MPT64(0.5 μg劑量)的反應陽性率分別為9/9、8/9和7/7。Rv3120(5 μg劑量)和MPT64(0.5 μg劑量)與TB-PPD(5 IU)皮膚試驗反應(24 h)硬結平均直徑差異均無統計學意義，而且其反應均為陽性(硬結平均直徑≥5 mm)，表明這兩種抗原具有較好的免疫原性。MPT64是MTB早期培養濾液主要的分泌蛋白之一，對MTBC有高特異性[6]。其能刺激γ干擾素(IFN-γ)的釋放，誘導細胞免疫反應，引起小鼠和豚鼠的T細胞反應和DTH[16-17]。重組蛋白CFP21-MPT64在檢測LTBI家庭密切接觸者時的敏感度(66.7%)略高于PPD皮膚試驗(61.1%)[6]。因此，可考慮將MPT64與其他抗原聯合使用，進一步研究。Rv3120屬于RD5區抗原，是一種假定蛋白，雖與重組結核桿菌融合蛋白(EC)相比(24 h和48 h)，皮試反應大小有顯著差異，但Zhang等[5]對60例HIV陰性肺結核患者和32名健康對照者的血清進行酶聯免疫吸附試驗，結果顯示，與已知抗原ESAT-6(敏感度為21.7%，特異度為90.6%)相比，Rv3120抗原具有更高的敏感度和特異度(敏感度為31.7%，特異度為96.9%)，可作為結核病免疫診斷的候選蛋白。Rv3619c屬于ESAT-6家族的早期分泌性抗原，能誘導抗原特異性IFN-γ的分泌和Th1型反應。研究證明，Rv3619c能誘導MTB感染的豚鼠發生DTH，是有效的T細胞抗原[18-20]。本研究結果顯示，Rv3619c(5 μg劑量)皮膚試驗反應(24 h)硬結平均直徑明顯小于TB-PPD(5 IU)和EC，但其硬結平均直徑大于陽性臨界值(5 mm)，反應陽性率較高(8/9)，在結核病診斷中有潛在價值。研究表明，部分MTB休眠相關抗原在LTBI人群中誘導的T細胞反應要明顯強于結核病患者[21]，而且不同抗原在LTBI人群中的血清抗體水平也不一樣[22]。本研究中，MTB休眠相關抗原Rv1738和Rv2626c在致敏豚鼠身上均未能顯示出明顯的DTH反應，其可能原因是感染后的豚鼠已處于MTB活躍狀態；同時，推測DTH主要由早期表達的蛋白引起，尤其是早期分泌型的蛋白。這為進一步優化皮膚試驗試劑提供了研發方向。

目前，檢測MTB感染的皮膚試驗試劑不斷改進，在使用效果方面，在減輕和減少不良反應的同時，DTH的特征更加明顯，特異性和敏感性也進入一個新的高度。但是，目前新型的以ESAT-6和CFP-10抗原為主的C-Tb試劑仍然存在紅腫發生率高[23]，DTH表現不夠明顯的問題；而抗原的聯合使用有助于提高MTB感染的診斷效果[24]。本研究目前尚處于蛋白抗原篩選階段，深入的蛋白組合及其最優劑量等方面尚需進一步研究，以期克服目前重組抗原EC等試劑存在的不足。