加味九分散對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠TRPV1 表達(dá)的影響

劉東武，高明利，于 靜

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，沈陽(yáng) 110032）

痛風(fēng)是尿酸鹽結(jié)晶誘發(fā)的晶體性關(guān)節(jié)炎，關(guān)節(jié)局部紅腫熱痛是本病主要臨床特點(diǎn)[1]。瞬時(shí)電位感受器香草酸受體1（transient receptor potential vanilloid-1，TRPV1）是溫度瞬時(shí)受體感受器的成員之一，參與熱痛覺(jué)敏化和炎癥反應(yīng)等多種生理病理過(guò)程[2]。目前TRPV1 是疼痛治療的重要靶點(diǎn)之一。加味九分散由馬錢子、麻黃、乳香、沒(méi)藥、大黃、薄荷、姜黃組成，具有活血散瘀，消腫止痛的作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察加味九分散外敷對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型關(guān)節(jié)皮膚和關(guān)節(jié)囊TRPV1 表達(dá)影響探討本方止痛作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料（220±20）g 雄性SD 大鼠，遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司提供，動(dòng)物合格證號(hào)scxk（遼）2015-0001。加味九分散組成：制馬錢子、麻黃、制乳香、制沒(méi)藥、姜黃、大黃、薄荷。藥材采購(gòu)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，取以上藥各30 g，將藥材打粉，過(guò)篩，混勻后乙醇調(diào)糊外用。扶他林乳膠劑購(gòu)自中美天津史克制藥有限公司，批號(hào)：7M5L。尿酸鈉結(jié)晶（MUS）（Sigama 公司），細(xì)胞蛋白抽取試劑盒、RIPA 裂解液（碧云天生物技術(shù)有限公司），TRPV1 抗體和二抗（愛(ài)博泰克生物科技有限公司），western 蛋白marker，BCA 蛋白定量試劑盒（凱基生物技術(shù)股份有限公司）。

1.2 分組與造模 將60 只雄性SD 大鼠隨機(jī)分4 組，分別為空白對(duì)照組（K）、模型組（M）、加味九分散組（Z），每組15 只。除空白對(duì)照組外均用尿酸鹽結(jié)晶局部注射造模。采用 Coderre 等[3]設(shè)計(jì)的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠造模方法。

稱取 0.2 g 尿酸鈉，充分研細(xì)，加入0.9%氯化鈉注射液4 mL，配成 5%尿酸鈉混懸液，無(wú)菌操作，用4 號(hào)注射針頭，將 5%尿酸鈉溶液0.1 mL 注入各組大鼠右后足內(nèi)踝的脛跗關(guān)節(jié)腔內(nèi)，每只動(dòng)物僅注射1 次。針頭探及關(guān)節(jié)囊有落空感為度，注射完成后觀察脛跗關(guān)節(jié)腔腫脹情況。

1.3 實(shí)驗(yàn)給藥 大鼠在實(shí)驗(yàn)室馴養(yǎng)1 周后造模，造模1 h 后加味九分散組開(kāi)始用藥，藥物外敷每8 h 1 次，共用藥6 次，每次維持1 h。

1.4 標(biāo)本取材方法 用藥48 h 后處死大鼠，取關(guān)節(jié)周圍皮膚和關(guān)節(jié)囊組織，提取關(guān)節(jié)局部皮膚和關(guān)節(jié)囊組織蛋白。

1.5 指標(biāo)檢測(cè) 用關(guān)節(jié)皮膚及關(guān)節(jié)囊組織，蛋白提取，蛋白做western-blot，步驟按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，使用Image J 軟件對(duì)蛋白表達(dá)進(jìn)行半定量分析，計(jì)算TRPV1相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用 SPSS 23.0 軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較經(jīng)方差齊性分析后采用成組設(shè)計(jì)的t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

Wetern-blot關(guān)節(jié)囊及關(guān)節(jié)皮膚TRPV1表達(dá) 見(jiàn)表1。

表1 關(guān)節(jié)囊及關(guān)節(jié)皮膚TRPV1 表達(dá)（，n=15）

表1 關(guān)節(jié)囊及關(guān)節(jié)皮膚TRPV1 表達(dá)（，n=15）

注：與空白組比較，# P ＜0.01，與模型組比較，△P ＜0.01

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為痛風(fēng)為濕熱瘀阻[4]，應(yīng)用清熱活血通絡(luò)藥物治療，針灸等中醫(yī)外治法對(duì)于痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性期治療效果明顯[5]。

《內(nèi)經(jīng)》中早有關(guān)于病機(jī)和治法的論述：“諸病胕腫，疼痛驚駭，皆屬于熱”“諸痛瘡瘍，皆屬于心（火）”“熱者寒之”。中醫(yī)理論認(rèn)為熱邪痹阻關(guān)節(jié)可以引發(fā)關(guān)節(jié)紅腫、灼熱、疼痛，清熱通絡(luò)藥物可以減輕濕熱痹阻引發(fā)的疼痛癥狀。

瞬時(shí)受體電位（Transient Receptor Potential，TRP）通道首次在基因突變的果蠅中被發(fā)現(xiàn)[6]，是一類跨細(xì)胞膜的非選擇性陽(yáng)離子通道，在感知溫度、pH 值、疼痛敏化等方面具有重要作用[7]。1997 年，Caterina等[2]在神經(jīng)元中首次克隆出了第一個(gè)辣椒素敏感受體，并命名為香草酸瞬時(shí)受體電位通道 transient receptor potential vanilloid-1(TRPV1) 。TRPV1 廣泛分布于神經(jīng)元、臟器上皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞等[8-9]。TRPV1 通道在體內(nèi)或體外均可被溫度刺激 (溫度＞ 42 ℃)激活，導(dǎo)致疼痛敏化，還可被多種內(nèi)源性及外源性理化刺激激活，酸性環(huán)境(pH 值＜5.9)、辣椒素以及內(nèi)源性質(zhì)子[2]。TRPV1 通道激活表達(dá)異常參與多種疾病的發(fā)病過(guò)程，如哮喘[10]、皮膚病[11]、關(guān)節(jié)炎[12]等等。以TRPV1 蛋白通道激動(dòng)劑及拮抗劑為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)的鎮(zhèn)痛藥越來(lái)越多，包括辣椒素、辣椒平（capsazepine）及苯并咪唑等[13]。

TRPV1 的發(fā)現(xiàn)給中醫(yī)研究者帶來(lái)了希望，成為了寒涼類和溫?zé)犷惖戎兴幖胺絼┲雇醋饔脵C(jī)制研究的熱點(diǎn)。部分熱性中藥成分能夠提高動(dòng)物機(jī)體能量代謝過(guò)程。周海玉[14]認(rèn)為，熱性中藥熱性屬性與其所含的TRPV1 通道激動(dòng)劑含量相關(guān)，可以提高機(jī)體感知溫度的活性，從而增加機(jī)體的能量代謝。吳茱萸含有TRPV1 受體激動(dòng)劑，其鎮(zhèn)痛作用與TRPV1 的脫敏有關(guān)[15]。生姜中含有6-姜酚具有類香草醇結(jié)構(gòu)，作為一種TRPV1 激活劑，可激活 TRPV1 受體并減少NFκB、細(xì)胞周期蛋白D1 含量，進(jìn)而抑制腫瘤進(jìn)展[16]。生物毒素（如狼蛛毒素）[17]等也可激活或調(diào)控TRPV1通道從而起到止痛作用。人參總皂苷對(duì) TRPV1 受體有激動(dòng)劑和抑制劑的雙向調(diào)節(jié)作用，在不同的內(nèi)環(huán)境條件下產(chǎn)生不同作用[18]。白芷水提液具有TRPV1 通道抑制活性，從而起到止痛作用[19]。Sui 等[20]發(fā)現(xiàn)芍藥甘草湯通過(guò)減少TRPV1 蛋白表達(dá)及降低該通道活性對(duì)關(guān)節(jié)炎疼痛大鼠模型起到鎮(zhèn)痛作用。電針治療也可以通過(guò)減少TRPV1 表達(dá)來(lái)減輕病理性疼痛[21]。

九分散由《中國(guó)藥典》收錄，源于費(fèi)山壽《急救應(yīng)驗(yàn)良方》，由馬錢子、麻黃、乳香、沒(méi)藥4 味藥組成。《慈禧光緒醫(yī)方選》《青囊全集》分別記載九分散，藥物組成與《中國(guó)藥典》記載之方藥略有差異。方中馬錢子、麻黃辛味走竄，善通絡(luò)止痛，乳香、沒(méi)藥行氣活血善治氣滯血瘀。古時(shí)本方多用于跌打損傷，現(xiàn)代醫(yī)家也將本藥用于治療痹證之疼痛癥狀[22]。加味九分散在本方基礎(chǔ)上加用大黃、姜黃、薄荷組成。大黃、姜黃活血化瘀，清熱利濕消腫，用于治療熱痹。加味九分散具有清熱通絡(luò)，活血止痛作用。本研究證明加味九分散通過(guò)減少痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠局部TRPV1 表達(dá)達(dá)到止痛作用。