苗藥黑骨藤中綠原酸在大鼠體內藥動學研究

劉 耀，胡 蝶，程 純，劉 杰，傅 建，徐 劍*

（1.貴州中醫藥大學，貴陽 550025；2.國家苗藥工程技術研究中心，貴陽 550025；3.貴州省普通高等學校中藥民族藥制劑重點實驗室，貴陽 550025）

苗藥黑骨藤為蘿藦科（Asclepiadaceae）杠柳屬（Periploca）植物黑龍骨（Periploca forrestii Schltr.）的干燥根或全株[1]，具有通絡、活血、解毒、祛風的功效。現代藥理研究表明，黑骨藤具有抗炎、鎮痛、抗腫瘤、免疫調節、抗氧化等作用[2-6]。化學成分研究表明，黑骨藤中富含黃酮、皂苷、多酚、揮發油等活性成分[7-11]。其中多酚類成分綠原酸的含量相對較高，其具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤、保護心血管及中樞神經系統、降糖、免疫調節等諸多藥理活性[12-19]，具有一定的代表性。本研究采用UPLC-MS/MS 技術建立了大鼠血漿中綠原酸濃度的測定方法，研究黑骨藤不同給藥劑量下綠原酸在大鼠體內的藥動學過程。

1 實驗材料

ACQUITY UPLC-Xevo TQ 超高效液相色譜-三重四級桿質譜聯用儀（美國Waters 公司）；Auw120D 型電子天平（日本島津公司）；MTN-2800D 氮吹儀（天津奧特塞恩斯儀器有限公司）；SK8210HP 超聲波清洗機（上海科導超聲儀器有限公司）；TGL-16B 高速離心機（上海安亭科學儀器廠），MX-S 渦旋儀（美國scilogex 公司），色譜柱ACQUITY UPLC CSH C18色譜(150 mm×3.0 mm,1.7 μm）（美國Waters 公司）。

黑骨藤飲片，購于貴州同濟堂中藥飲片有限公司；綠原酸對照品（批號：110753-201415，中國食品藥品檢定研究院）；葛根素對照品（批號：110752-201514，中國食品藥品檢定研究院）；甲醇（批號：17080670，TEDIA 公司，色譜純）；乙腈（批號：17080654，TEDIA 公司，色譜純）；甲酸（批號：J259K144，德國CNW 公司，色譜純）；純凈水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）；肝素鈉(批號：160228，上海藍季生物）。

18 只SD 大鼠，雌雄各半，體質量150～180 g，購自于長沙市天勤生物技術有限公司，合格證編號：SCXK（湘）2014-0011，動物房環境：溫度18～26 ℃，相對濕度40%～70%。

2 方法

2.1 色譜與質譜條件 色譜條件：色譜柱為ACQUITY UPLC CSH C18（150 mm×3.0 mm,1.7 μm）色譜柱，流動相為乙腈-水（0.2%甲酸）（體積比20：80）等度洗脫，流速為0.3 mL/min，柱溫25 ℃，進樣體積為2 μL。質譜條件：采用電噴霧（ESI）離子源，毛細管電離電壓：3 kV；離子源溫度：120 ℃；去溶劑氣溫度：550 ℃；掃描方式為正離子多反應離子檢測模式，用于定量分析監測的離子反應為：綠原酸m/z355.32 →163.2，葛根素m/z417.220 →297.136；錐孔電壓8 V，碰撞能量為24。

2.2 對照品與內標溶液的制備 精密稱取綠原酸對照品適量，加甲醇濃度為165.6 μg/mL 的標準溶液，于4 ℃下避光保存，臨用時取出稀釋至所需濃度。精密稱取葛根素對照品適量，加甲醇溶解制成，濃度為166.8 μg/mL 的內標溶液，于4 ℃下避光保存，臨用時取出稀釋至所需濃度。

2.3 給藥 取18 只SD 大鼠，隨機分為3 組，按不同劑量灌胃給予黑骨藤藥材提取物（以提取物中綠原酸含量計算，低劑量6.4 mg/kg、中劑量13.1 mg/kg、高劑量25.0 mg/kg），于給藥前及給藥后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、4、6、8、10、12 h 經大鼠眼眶取血，置于肝素鈉處理的EP 管中，8 000 r/min 離心15 min，取上層血漿，-20 ℃冷凍保持備用。

2.4 血漿處理 取上述血漿樣品100 μL，置于1.5 mL的EP 管中，精密加入內標溶液10 μL，渦旋震蕩1 min，加入400 μL 乙腈，渦旋震蕩3 min，于14 000 r/min 離心10 min，取上清液，于35 ℃下N2 吹干，用100 μL 的甲醇復溶，渦旋震蕩3 min，超聲1 min，于14 000 r/min 離心10 min，取2 μL 采用UPLC-MS/MS 進行檢測分析。

2.5 數據處理 將采集所得到的不同時間點大鼠血藥濃度數據采用DAS 2.0 軟件進行分析處理，得到不同給藥劑量黑骨藤中綠原酸的藥動學參數，數據以均數±標準差（）表示，進行藥動學分析，并繪制平均血藥濃度-時間曲線。

3 結果

3.1 方法學考察

3.1.1 專屬性試驗 按上述色譜條件，比較空白血漿、空白血漿加綠原酸和葛根素和給予黑骨藤提取物后大鼠血漿樣品色譜圖，結果表明大鼠血漿中內源性物質對于綠原酸和內標物葛根素的測定沒有干擾，綠原酸和內標物葛根素的保留時間分別為3.94 min 和3.32 min，表明該方法具有良好的專屬性，結果見圖1。

圖1 血漿中綠原酸和葛根素MRM 色譜圖

3.1.2 線性范圍與定量限 取大鼠空白血漿100 μL，加入不同濃度的綠原酸標準溶液10 μL 及0.166 8 μg/mL的葛根素內標溶液10 μL，其余按“2.4”項下方法配制相當于綠原酸血漿質量濃度分別為0.018、0.045、0.090，0.255、0.450、2.250 μg/mL 的樣品。在“2.1”條件下，進行分析，以綠原酸濃度為橫坐標（X），以綠原酸與內標物葛根素的峰面積比值為縱坐標（Y），得回歸方程為：Y=3.422 1X-0.011 6（r=0.999 9），結果表明綠原酸在0.018～2.250 μg/mL 范圍內線性關系良好，綠原酸最低定量限（LOD）為0.018 μg/mL。

3.1.3 精密度及準確度試驗 精密吸取空白血漿100 μL，加入不同濃度的綠原酸標準品溶液，配制成定量下限及高、中、低4 種濃度（18、90、450、2 250 ng/mL）的質控樣品，每種濃度各5 份樣本，按“2.4”項下進行操作，按“2.1”項下條件連續測定3 d，將峰面積比值代入標準曲線進行計算。對比實測與已知樣品濃度，計算綠原酸的日內、日間精密度（RSD）及準確度，結果表明，該方法的精密度和準確度符合生物樣品定量分析方法要求，結果見表1。

3.1.4 穩定性試驗 精密吸取空白血漿100 μL，加入不同濃度的綠原酸標準品溶液，制備成高、中、低3種濃度（90、450、2250 ng/mL）的質控樣品，每種濃度各5 份樣本，按“2.4”項下進行操作，分別考察25 ℃放置24 h，-80 ℃反復凍融3 次的穩定性。結果表明樣品放置于不同的溫度下穩定性良好，結果見表2。

3.1.5 基質效應與回收率試驗 精密吸取空白血漿100 μL，加入不同濃度的綠原酸標準品溶液，配制成高、中、低3 種不同濃度（90、450、2 250 ng/mL）的質控樣品，每種濃度各6 份樣本，按“2.4”項下進行操作，按“2.1”項下條件進行分析，計算綠原酸與內標物葛根素峰面積的比值為A；另取空白血漿100 μL，按“2.4”項下不加入內標溶液操作至乙腈沉淀蛋白，吸取上清液，向其中加入上述相應濃度的綠原酸與葛根素混合對照品溶液，按“2.1”項下條件進行分析，計算其峰面積之比為B；取上述相應濃度的綠原酸及葛根素混合對照品，按“2.1”項下條件進行分析，計算其峰面積之比為C。其中基質效應=B/C×100%，回收率=A/C×100%。結果表明，綠原酸的提取回收率88.76%～113.28%，RSD 小于4.68%；綠原酸基質效應范圍為88.01%～99.83%，RSD 小于7.97%，符合生物樣品定量分析方法要求，結果見表3。

表1 UPLC-MS/MS 法測定黑骨藤中綠原酸的精密度與準確度

表2 UPLC-MS/MS 法測定黑骨藤中綠原酸穩定性考察結果

表3 大鼠血漿中綠原酸提取回收率及基質效應（n=6）

3.1.6 殘留考察 在進樣定量上限綠原酸對照品后進樣空白血漿樣品，結果空白血漿樣品中未顯示任何顯著的峰（≥20%的綠原酸對照品和5%的內標），且本研究采用等度洗脫結束后平衡1 min，加上儀器自帶的洗針系統，可以有效的避免了樣品殘留問題。

3.2 藥動學研究 采用DAS 2.0 軟件對大鼠給藥后的不同時間血藥濃度數據進行房室模型擬合，發現不同給藥劑量黑骨藤中綠原酸在大鼠體內的藥動學過程均與一室房室模型符合較好，擬合后的藥動學參數見表4，藥-時曲線見圖2。

表4 不同給藥劑量綠原酸大鼠體內藥動學參數（，n=6）

表4 不同給藥劑量綠原酸大鼠體內藥動學參數（，n=6）

圖2 不同給藥劑量綠原酸大鼠藥-時曲線

4 討論

4.1 測定方法 本試驗采用UPLC-MS/MS 法，對大鼠血漿中的綠原酸進行測定，較傳統的HPLC 法，具有快速、靈敏度高等優點，僅需5 min 即可完成大鼠血漿樣品的分析，并采用MRM 模式可快速篩查出血漿樣品中的目標成分，具有極高的靈敏度與專屬性。

4.2 內標的選擇 葛根素與綠原酸結構相似，均具有多個苯環及酚羥基，在測定的色譜條件下進行分析，葛根素保留時間適宜，與目標成分綠原酸完全分離，峰型良好，且血漿中內源性物質對檢測沒有干擾，故選擇葛根素為綠原酸血漿樣品測定的內標。

4.3 黑骨藤中綠原酸在大鼠體內的藥動學行為 大鼠口服給予黑骨藤后，對高、中、低不同劑量所獲得的藥動學參數Cmax 及AUC0-t 與給藥劑量進行一元線性回歸分析，分別得到回歸方程為：Y=0.031 3X-0.029 9（r=0.999），Y=0.119 1X-0.047 89（r=0.988），表明在6.4～25 mg/kg 劑量范圍內，黑骨藤中綠原酸在大鼠體內表現為線性動力學特征，各劑量下綠原酸達峰時間（Tmax）均為1.5 h。較文獻對比[20-22]，黑骨藤中綠原酸的吸收出現滯后現象，不同劑量給藥后Tlag分別為0.450、0.466、0.425 h，提示黑骨藤中其他化學成分可能會對綠原酸的吸收產生競爭抑制作用。經過統計學分析，低劑量組與中、高劑量組結果有顯著差異（P＜0.05），結果提示不同給藥劑量對大鼠體內綠原酸的消除速度有一定影響，隨著劑量的遞增，消除速度逐漸減小，當達到一定劑量后趨于平衡。

綜上所述，本試驗采用UPLC-MS/MS 法建立了一種快速、準確、高靈敏度的大鼠血漿中綠原酸含量分析方法。并將其應用于黑骨藤中綠原酸在大鼠體內的藥動學研究，結果可為苗藥黑骨藤的藥物研發和臨床合理用藥提供了一定理論依據。