電針人中穴對腦梗死大鼠腦組織中血管生成素-2 的影響

王麗芬，姚艷玲，崔景軍

（1.陜西省中醫醫院，西安 710000；2.陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 712046；3.滄州中西醫結合醫院，河北 滄州 061000）

腦梗死（cerebral infarction），全球死亡率高達11%，且幸存者永久性殘疾的發生率高[1-2]，已成為威脅人類生命健康的首要疾病。但臨床治療手段仍然非常有限，挽救梗死周邊的缺血半暗帶區尚未完全壞死的神經、血管的功能是現代治療的基礎，但其可逆性受治療時間窗（TTW）的限制，一般不超過6 h[3]。研究表明，基于炎癥、氧化應激等化學原因，西藥因治療目的單一及不良反應多，通常難以獲得令人滿意的臨床結局[4]。因此，探索更有效的治療手段迫在眉睫。神經功能的恢復依賴于血流供應，在急性缺血期改善腦循環非常重要，血管新生被認為是一種潛在的治療策略。研究發現，針刺人中穴能在腦梗死（MCAO）后早期促進血管內皮細胞增殖，改善腦組織供血[5]，但其機制不明，有待進一步研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 5～6 周齡健康雄性Wistar 大鼠160 只，體質量180～200 g，SPF 級；西安交通大學實驗動物中心提供。根據信封法產生隨機序列，分為模型組50 只、針刺組50 只、假手術組50 只、空白對照組10 只。前3 組又按術后3 h、12 h、24 h、2 d、3 d各分為5 個時相，每時相各10 只。

1.2 主要試劑與儀器 華佗牌針灸針（蘇州醫療用品廠有限公司）；G6805-2A 型華誼電針儀（上海華誼醫用儀器有限公司）；生物潔凈工作臺BCM-IOOOA 型（蘇州安泰空氣技術有限公司）；離心機3K18 型（SIGMA，德國）；高速冷凍離心機（美國BECKMAN公司）；垂直電泳槽、轉膜槽（美國伯樂公司）；Lab WorksTM 凝膠成像及分析系統（UVP，美國）；Realtime PCR 儀（Roche LightCycler 480，瑞士）；高倍倒置電子顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；酶標儀（鄭州博賽生物技術有限公司）；高壓蒸汽消毒鍋（山東新華安得醫療用品有限公司）；GIS-2008 數碼凝膠圖像分析處理系統（上海天能科技有限公司）；PBS（北京中杉生物公司）；RIPA 裂解液（北京博奧森生物技術有限公司）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（北京博奧森生物技術有限公司）；ECL 發光試劑盒（美國MillPore 公司）；丙烯酰胺、甲叉聚丙烯酰胺、SDS、TEMED、APS、溴酚藍、Tris 堿、甘油、麗春紅染色劑、甘氨酸為Sigma 公司產品；濾紙、鹽酸、顯影液、定影液、96 孔板及其他耗材由西安醫學院生命科學實驗中心實驗室提供。

2 實驗步驟

2.1 模型復制及處理方法 MCAO 模型復制[1-3]：10%水合氯醛以0.35 mL/100 g 腹腔注射麻醉，鉗夾大鼠的尾根部，無體動反應時，頸部正中部備皮，仰臥位固定，消毒。頸正中切口，鈍性分離右側 CCA、ICA及ECA，暫時夾閉CCA 和ECA，在兩動脈間剪一小切口，插入約（20.00±2.00）mm 的線栓，感到阻力時停止。固定線栓、剪除殘留線栓尾端、縫合傷口，并燈光輻射保溫。術后檢測大鼠的身體狀況。

空白組不采取措施。

假手術組除了不插入尼龍線外，其余均同模型組。

針刺組根據華興邦的動物穴位圖譜定位，大鼠“人中”穴，0.5 寸毫針向上斜刺，并在該部位下約2 mm處毫針刺入作為參考電極，人中穴接電針儀的正極，參考電極接負極，用15 Hz，1 mA 連續波不間斷刺激20 min。

2.2 動物模型的評價 MCAO 模型排除標準：1）實驗過程中大鼠死亡；2）斷頭取腦時，發現ICA 分叉處出血者。

2.3 Ang-2 RNA 的檢測 將大鼠在相應時點快速斷頭處死后，取出其缺血核心區腦組織，液氮速凍，-80 ℃冰箱保存備用。用 Trizol 提取總RNA，取 5 μL 進行逆轉錄后取2 μL 進行 PCR 反應，GAPDH 為內參照，熒光定量PCR 法測定Ang-2 RNA 的表達。引物及探針均由 Invitrogen 公司設計與合成。

2.4 Western 印跡法檢測Ang-2 的蛋白表達 將各時相滿足標準的所有大鼠麻醉后迅速斷頭取腦，并將動脈閉塞組織在液氮中快速冷凍并在-80 ℃下儲存，將樣品在冷裂解緩沖液中勻漿，提取并測定蛋白含量。根據蛋白量配制SDS-PAGE 緩沖液，95 ℃ 變性10 min，電泳分離，半干轉至 PVDF 膜上，用含 5%脫脂奶粉的 TBS 封閉 1 h。與兔抗大鼠 Ang-2 多克隆抗體（1:500），4 ℃ 孵育過夜，TBST 溶液洗滌 3 次后與H R P 標記的二抗（1:5 000）室溫孵育，暗室曝光及洗片，按1:1 比例與 ECL 發光液混合，在凝膠成像系統下曝光并成像，保留圖片。運用Image J 軟件處理并分析目標條帶與內參條帶的吸光度值，將目的條帶與內參條帶的比值作為蛋白相對表達量。

2.5 統計學方法 采用SPSS 22.0 中的ANOVA 分析數據。

3 實驗結果

3.1 Ang-2 RNA 的PCR 分析 空白組與假手術組各時相 Ang-2 RNA 表達無明顯差異（P＞0.05）。模型組Ang-2 RNA 表達MCAO 術后3 h 開始上調，在術后24 h時相達高峰，各時相表達均高于空白組（P＜0.05）。電針組Ang-2 RNA 表達MCAO 術后3 h 上調，在術后12 h 時相達高峰。除術后3 h 時相外，其余各時相均明顯高于同時相模型組（P＜0.05），見圖1。

圖1 電針人中穴對MCAO 大鼠腦組織Ang RNA 表達的影響

3.2 Ang-2 蛋白表達的Western 印跡分析 假手術組與空白組Ang-2 蛋白表達比較差異無統計學意義，P＞0.05。模型組Ang-2 蛋白表達MCAO術后3 h開始增高，在術后24 h 時相達高峰，各時相表達均高于空白組（P＜0.05）。電針組Ang-2 蛋白表達MCAO 術后3 h呈增高趨勢，在術后12 h 時相達高峰。除術后3 h 時相外，其余各時相均明顯高于同時相模型組（P＜0.05）。見圖2、圖3。

圖2 電針人中穴對MCAO 大鼠梗死腦組織Ang-2 蛋白表達的影響

圖3 電針人中穴對MCAO 大鼠梗死腦組織Ang-2 蛋白表達的影響

4 討論

最新的腦卒中診治指南指出急性腦梗死是腦卒中最常見的類型[6]。腦梗死發生后，其始動環節為腦缺血導致局部腦血流量下降，故治療的總思路為增加腦組織血流量。而改善腦循環的最佳治療時間應在發病后2～3 d 之內[7]。故本研究選取的時相以MCAO 后3 d 之前為主。目前腦梗死的治療方法多種多樣，以挽救缺血半暗帶區尚未完全壞死的神經元功能，增加血流供應為目標[8]。藥物治療必須以良好的血流供應為前提，才能被運送到靶器官，在腦梗死早期腦組織絕對缺血的情況下是不可取的[9]。針刺療法不絕對依賴于血供，可通過刺激神經傳導至靶器官，彌補了藥物治療的弊端。

“醒腦開竅”針法用于治療腦梗死由來已久，已得到了廣泛的認可[10]。其中“人中穴”是用于急救的穴位，具有醒腦神、開清竅的作用，刺之可激發大腦神氣，就解剖位置而言，人中穴局部有面神經及三叉神經的分支，刺激可傳導至面部腦血管舒張中樞蝶腭神經節及“三叉神經-腦血管系統”，起到舒張微血管，增加腦血流量的作用[11]。有研究證實，這一作用是通過缺血半暗帶的血管新生實現的[12]。另外，電針作為臨床常用手段，可促進腦組織損傷修復和舒張血管，進一步加強人中穴的作用[13-14]。

前期研究表明，電針人中穴可增加梗死局部及健側的腦血流量（rCBF），縮小腦梗死體積[15-16]。而MCAO 術后大鼠rCBF、腦梗死體積的變化亦與血管新生密切相關[17]。血管新生是一個多種因子共同參與的過程，其中，血管內皮生長因子（VEGF）及其受體系統是整個腦缺血后血管新生調控的中心環節[18]。電針人中穴可促進 VEGF 的增殖，并使VEGF 增殖的時間提前，建立有效的側枝循環[19]。血管生成素（Ang）是一族特異性血管新生作用因子，參與內皮細胞增生、遷移、基底膜分解及血管腔形成等血管生成的各個生理環節[20]。其家族有4 型，對血管新生起主要作用的有Ang-1、Ang-2[21]。Ang-2 對血管生成的影響依賴于VEGF，腦梗死發生后，隨著VEGF 的增殖，Ang-2 可松解血管壁，增強內皮細胞的反應性，協同作用促進新的毛細血管形成[22-23]。

本研究結果表明，腦梗死早期電針人中穴可上調血管生成素-2 的基因和蛋白表達，促進Ang-2 的增殖，并使其峰值提前，達到促進血管新生，改善腦組織梗死區缺血半暗帶血流供應的作用。